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腾讯登录使用纳米孔测序对 BRCA1 和 BRCA2 基因进行表征和变异识别
| 导读 | 纳米孔测序与混样扩增测定配合使用时，可进行BRCA变异检测；与自适应采样配合使用时，可同时测定突变和甲基化状态。 |
纳米孔测序与混样扩增测定配合使用时，可进行BRCA变异检测；与自适应采样配合使用时，可同时测定突变和甲基化状态。
BRCA1和BRCA2在通过DNA修复维持基因组稳定性方面发挥重要作用
图1BRCA 突变a) 和癌症风险b) 突变破坏的机制c) 基因座
BRCA1和BRCA2基因中致病变异或启动子的高甲基化可导致若干种癌症的风险增加（图1a）。基因在通过同源重组(HR)修复DNA双链断裂中发挥重要作用（图 1b），而且BRCA活性的丧失会导致同源重组缺陷(HRD)和基因组不稳定。建议对特定类型的癌症（包括乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌）患者进行胚系BRCA1/2检测。BRCA缺失的患者可从PARP抑制剂治疗中获益。由于存在假基因和重复序列，可能难以检测到BRCA基因中的突变（图1c）。
利用PCR测定法测定BRCA1/2突变状态
图2BRCA PCR 测定a) BRCA1/2的读长序列定位 b) 检测插入缺失
对涵盖十种临床相关变异（8个SNP和2个插入缺失）的两个种系参考标准品进行了BRCA1/2扩增，然后使用LSK114进行文库制备。定位到GRCh38的读长序列显示，使用嵌合PCR 方法扩增两个基因的所有外显子，最大扩增子大小为360bp（图2a）。成功鉴定所有预期变异，无假阳性。还测试了五份含致病BRCA变异的人体细胞系衍生gDNA样本，并成功识别了所有变异。所示的两个示例证实，在一个同聚物中分别成功检测到单碱基插入和单碱基缺失（图2b）。
使用嵌合1kb PCR扩增子同时扩增BRCA1和BRCA2基因
图3全基因BRCA PCR a)嵌合策略，b) 与BRCA2 比对的扩增子
Oxford Nanopore测序在读长序列长度方面没有固有限制，因此可对较长的扩增子进行整体测序。假基因和重复序列的存在会增加定位难度，而较长的扩增子有助于明确定位。此外，在使用嵌合PCR 方法时，较大的重叠距离可能有助于基因片段的定相（图3a）。尝试在整个基因上嵌合可以识别内含子和外显子变异。研究人员测试了嵌合引物设计，以尝试在含大约500 bp 重叠的约1 kb扩增子中进行完整的BRCA1和BRCA2基因测序。尽管该设计仍处于开发阶段，但嵌合扩增子方法捕获了全部特定基因区域，而且在外显子和内含子区域中识别了样本中的已知变异（图3b）。
在完整的遗传性癌症组合中完成BRCA基因座的表征
图4利用BRCA1和BRCA2展示的遗传性癌症综合组合
我们使用自适应采样组合，设计了一个涵盖200个基因的遗传性癌症组合。该组合包含的基因与许多种癌症类型相关。此处展示了BRCA1和BRCA2的结果示例。定位到GRCh38组装的读长序列显示，两个基因得到完整覆盖，包括内含子区域（图4a和图b）。该样本包含成功检测到的BRCA1中的单碱基插入（图4c）。使用该方法可以检测到BRCA基因中的结构变异，因为自适应采样可兼容长读长序列。不过，此样本中不存在结构变异。可对整个BRCA2基因进行定相并用于单倍型特异性分析（图4d）。此示例显示了整个BRCA2的单倍型甲基化数据（图4e）。
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