利用超长读长序列和Pore-C获取前所未有的单倍型解析生物学信息

许多组装方法将二倍体基因组折叠成一个单倍体组装，即随机混合两个单倍型的变异（图1a)。因此，每个折叠组装的每个重叠群/Scaffold均具有来自两个亲本的k-mer（图1b）。而更好的方法是对每个单倍型进行单独组装，这通常通过Trio binning来实现。该方法从各个亲本的数据中提取特异性k-mer，并使用它们来将读长序列分配到父本或母本，然后分别组装这两组数据。这样，每个单倍型拥有一个组装，而每个组装的每个重叠群/Scaffold仅具有来自一个亲本的k-mer（图1c）。不过，亲本数据并非随时可得。我们在此提供一种替代方法，可基于长读长和Pore-C数据进行定相，为读长序列分配单倍型时不需要亲本数据。该工作流程基于DipASM，首先将纳米孔读长序列折叠组装，重新比对出长读长序列，然后识别变异（图1d）。接下来，将这些变异定相为染色体规模的定相区块。我们从每条染色体中获得一个定相区块，其中包含几乎所有正确定相的变异（图1e）。下一步，使用定相过的变异标记读长序列，并为其分配单倍型。绝大多数的碱基对可以通过这种方式定相。在最终组装步骤中，会为每个单倍型生成一个染色体规模的组装。组装而成的Scaffold 来源于父本或母本单倍型，并且具有人类参考基因组规模的N50（图1f和1g）。如果没有trio（母本、父本和孩子）信息，则很难区分父本和母本Scaffold，这种情况下，两个组装均为父本和母本Scaffold 的混合物。最后，图1h和1i显示了两个已组装单倍型的点阵图，并与 T2T CHM13组装进行比较。

基因组和表观基因组变异之间的许多相互作用发生在顺式序列中，即染色体的同一拷贝上。传统上采用trio测序（对先证者、母本和父本进行测序）寻找变异与其亲本来源之间的相互关联。但是，这种方法有许多缺点：可能难以获得亲本样本；亲本样本测序的费用更高；以及不适用于所有三个样本中的杂合基因座。使用超长读长序列（读长N50 >50 kb）可在数百Mb的序列中定相SNP，Pore-C读长序列则实现了染色体规模的定相（图 2a）。后续对读长序列进行单倍型标记，可以同时定相基因变异和甲基化，识别单倍型特异性差异甲基化区域（单倍型DMR）和给定的亲本来源特异性单倍型DMR (pDMR)，并为基因变异分配亲本来源。为了说明这一点，我们使用亲本组装定相了18个HPRC数据集，并使用DSS识别了pDMR（图2b）。结果发现249个pDMR的平均亲本富集>1σ，这些DMR与我们的ULK和ULK + Pore-C数据集中的大多数定相区块重叠（图 2c 和图d）。利用原始贝叶斯分类器，我们分别使用ULK和ULK+Pore-C数据为51%和94.3%的变异正确分配了亲本来源，精确度分别为93%和96.5%（图2e和图f）。图2g展示了可与来源染色体相关的多个单倍型DMR以及杂合SNP和SV。

2023年5月11日，我们邀请到中国科学院昆明动物研究所侯春晖研究员在Oxford Nanopore大中华区用户会成都场分享他利用Oxford Nanopore纳米孔长读长和Pore-C数据的研究成果：“高通量Pore-C揭示了单等位基因拓扑结构和三维基因组折叠的细胞类型特异性”。