最新！李劲松、汤富酬、吴立刚、徐国良发现DNA甲基化在小鼠原肠胚形成过程中的关键作用

5月22日，中国科学院上海生物化学与细胞生物研究所/中国科学院分子细胞科学卓越中心李劲松、吴立刚、徐国良及北京大学汤富酬共同在《Nature Communications》发表题为“Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation”的研究论文，研究揭示了启动子甲基化与抑制miRNA表达之间的表观遗传相关性，并证明IMGZ可以加速破译体内多个基因的功能。

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38528-z

研究背景

在胚胎发生过程中，复杂的调节因子，包括表观遗传和转录因子，协同调节谱系分化、组织模式和器官发生。这些因素的遗传破坏有助于我们了解胚胎发生过程中这些调节因子的分子功能，然而，家族基因相关的补偿机制可能使单个突变的结果难以解释。而且，生物事件的基本作用，如由Tet家族基因诱导的DNA去甲基化，无法从部分家族基因突变的小鼠模型中揭示。因此，有必要在受精卵中同时灭活所有家族基因，以揭示生物过程的生理作用。常规策略是基于种系特异性敲除小鼠模型建立复杂的育种系统。然而，这些策略既费时又费力。总之，有效地产生具有家族基因突变的胚胎仍然是一个未实现的目标。

在这项研究中，我们建立了一个碱基编辑器（hA3A-eBE-Y130F）介导的IMGZ系统，该系统能够在一步中高效生成具有多个突变基因的胚胎，从而加速在胚胎发生过程中从功能上破译生物过程的意义。

研究进展

为了有效地诱导小鼠胚胎中的终止密码子突变，我们试图从六个可用系统中鉴定出效率最高的基于CRISPR的碱基编辑器（BE），包括BE3，Gam-BE4，hA3A-BE3-Y130F，X-BE3和X-BE3。我们首先将其中一个BE系统的mRNA和靶向Oct4-EGFP转基因的sgRNA注射到受精卵中，根据既定的方案，在EGFP转基因中引入过早终止密码子。结果表明，hA3A-eBE3-Y130F22在所有测试的BE系统中，产生的囊胚中C到T的转换效率最高（~90%），纯合突变的比例更高，副产物更少。我们还在晶体蛋白γC（Crygc）的内源性基因位点测试了这些BEs，并观察到类似的结果。我们进一步优化了进样条件，发现分别100 ng/μl的hA3A-eBE3-Y130F和sgRNA具有最高的编辑效率和更少的副作用。最后，GOIT（通过双细胞胚胎注射进行全基因组脱靶分析）23对三个内源基因（Tyr、Crygc和Dnmt3a）的分析表明，hA3A-eBE3-Y130F诱导脱氨酶活性引起的轻微和随机脱靶突变,与之前报告的其他BE系统相同。 

筛选高效的基础编辑器并分析其脱靶效应

研究意义

总之，在这项工作中，我们从六个可用系统中筛选出最有效的胞嘧啶碱基编辑器，并确定hA3A-eBE3-Y130F可以通过受精卵注射有效地在目标位点引入终止密码子。接下来，我们建立了基于hA3A-eBE3-Y130F的IMGZ（受精卵中多个基因的失活）系统，以有效地产生Tet和Dnmt家族基因之间具有多个突变基因的胚胎。通过这些突变胚胎，我们通过调节独立于TET蛋白的miRNA的剂量，发现了Dnmt家族基因对胚胎原肠胚形成的关键作用（转化医学网360zhyx.com）。

参考资料：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38528-z

注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。