【Cell Death Dis】第四军医大学：显著改善胃癌治疗，可驱动胃癌细胞转移

癌症相关成纤维细胞(CAFs)的分泌特性在形成促转移性肿瘤微环境中起主要作用。本研究发现，由cas产生的轴突引导蛋白SLIT2通过与迂回引导受体1 (ROBO1)结合，促进两种胃癌细胞系(AGS和MKN45)的胃癌转移。

质谱分析显示，ROBO1可以与NEK9相互作用，NEK9是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。SLIT2进一步增强了它们的相互结合活性。结构域分析表明，NEK9的激酶结构域在其与ROBO1胞内结构域(ICD)的相互作用中起关键作用，并在AGS和MKN45细胞中直接磷酸化tripartite motif containing 28 (TRIM28)和cortatin (CTTN)。TRIM28作为转录延伸因子，直接促进CTTN的激活。此外，生物信息学分析和实验验证发现TRIM28对STAT3和NF-κB p100的转录有调控作用，并且在AGS和MKN45中也观察到STAT3和NF-κB p100对CTTN的协同转录。因此，caff衍生的SLIT2增加了CTTN的表达和磷酸化水平，从而诱导细胞骨架重组和GC细胞转移。通过IHC和Multiplex IHC发现，与配对的非癌组织和原发癌病变相比，转移性胃癌病变中NEK9、TRIM28和CTTN的表达水平同时升高。对一组GC患者数据的分析显示，NEK9、TRIM28和CTTN水平的升高与总生存率的降低有关。总的来说，这些发现揭示了CAFs与癌细胞通过SLIT2/ROBO1和炎症信号传导的联系，参与这一过程的关键分子可能成为潜在的GC生物标志物和治疗靶点。

https://www.nature.com/articles/s41419-023-05965-z

研究背景

 01 

癌症的发生、发展和转移在宿主组织中引起广泛的动态变化，导致复杂肿瘤基质的形成，也称为肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)。很明显，与细胞骨架重塑相关的基因的平衡激活和失活的丧失是癌症转移的关键步骤。然而，癌症的进展和转移并不仅仅依赖于癌细胞自主缺陷，来自TME的刺激触发或增强了这一过程，创造了一个局部微环境，使癌细胞获得过度的运动能力，迁移到远处的位置，形成转移龛。

TME的主要组成部分是成纤维细胞，多年来的许多研究表明，成纤维细胞在癌症转移中具有突出的功能作用。静止或静止的成纤维细胞在肿瘤引起的组织损伤时被激活。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达是成纤维细胞活化的标志。这些细胞可能获得进一步的分泌表型和强大的自分泌激活，在癌症病变发展的持续和不减弱的压力下转化为癌症相关的成纤维细胞(CAFs)。CAFs通过其分泌组特性直接或间接影响肿瘤进展和肿瘤免疫。据报告，CAFs分泌多种生长因子、趋化因子和细胞因子，如TGF-β、IL-6和一系列CC趋化因子(1至5)。这些因子可以产生增强的炎症微环境，它们与癌细胞上的受体结合也会启动转移相关基因的异常激活。

SLIT2是一种轴突引导蛋白，最近被认为是由cas分泌的。其与迂回引导受体1 (ROBO1)结合可影响β-catenin/LEF/TCF、PI3K/Akt、CXCL12/CXCR4、RAFTK/Pyk2等多种下游通路，调控肿瘤侵袭转移。作者实验室主导的多项研究明确阐明了SLIT2/ROBO1在胃癌(GC)转移中的上游机制。SLIT2被发现与miR-218相关，miR-218直接靶向ROBO1、POU2类同源盒2 (POU2F2)和IKK-β。此外，IKK-β激活NF-κB，进一步促进NF-κB对POU2F2的转录激活。然后，POU2F2通过其转录活性继续调控ROBO1。然后，ROBO1、POU2F2和IKK-β形成一个正反馈回路，放大SLIT2刺激产生的信号。作为一种跨膜蛋白，ROBO1与SLIT2结合，在靶细胞中参与一系列信号转导机制。先前的研究表明，ROBO1可以与一小群Rho GTPase激活蛋白相互作用，这些蛋白可以直接影响RhoA和Cdc42的激活状态，从而导致细胞骨架的重组。这一现象似乎是SLIT2/ROBO1调控细胞运动的基础;然而，与robo1相互作用的蛋白质的光谱尚未被充分探索。SLIT2/ROBO通路是否在CAFs来源的细胞因子诱导的炎症微环境中发挥作用也有待确定。

本研究利用质谱(MS)分析了ROBO1的相互作用蛋白。作者在之前的研究中发现，丝氨酸/苏氨酸激酶NEK9是IL-6的效应物，它与ROBO1直接相互作用，成纤维细胞衍生的SLIT2进一步增强了它们的相互结合活性。NEK9的激酶结构域在其与ROBO1的胞内结构域(ICD)相互作用中起关键作用，并直接磷酸化tripartite motif containing 28 (TRIM28)和cortatin (CTTN)。TRIM28作为转录延伸因子，直接促进CTTN的激活。此外，生物信息学分析和实验验证发现TRIM28对STAT3和NF-κB p100的转录有调控作用，并且在AGS和MKN45中也观察到STAT3和NF-κB p100对CTTN的协同转录。因此，cafs衍生的SLIT2增加了CTTN的表达和磷酸化水平，从而诱导细胞骨架重组，导致癌细胞获得过度的迁移能力。本研究结果揭示了CAFs与癌细胞通过SLIT2/ROBO1和炎症信号传导之间的关联，所涉及的关键分子可能作为GC的潜在生物标志物和治疗靶点。

研究结果

 02 

CAF- SLIT2与ROBO1结合促进胃癌转移和细胞骨架重组

采用免疫组化和IF染色法检测SLIT2在胃癌组织正常成纤维细胞和CAFs中的表达和定位。通过免疫组化检测，与邻近非肿瘤组织相比，GC组织的cas(红色箭头)中检测到SLIT2升高。与正常成纤维细胞相比，GC组织的cas中SLIT2表达增加。用α-SMA标记CAFs，证实α-SMA与SLIT2共免疫染色，提示SLIT2是由CAFs分泌的。采用ELISA法检测血清SLIT2水平(n = 96)，结果显示GC患者SLIT2水平显著升高。重组SLIT2蛋白处理(100 ng/ ml, 24小时)增强了MKN45和AGS细胞的迁移能力。通过细胞骨架染色在GC细胞中观察到规则的细胞形状和肌动蛋白应力纤维，SLIT2诱导向纺锤样形状过渡，形成板足。SLIT2对胃癌细胞的所有这些作用均被ROBON(一种可溶性rob1受体拮抗剂)阻断，提示SLIT2以rob1依赖性的方式促进胃癌转移。在体外实验中，CAFs及其培养上清液均可促进胃癌细胞的迁移，而CAFs中ROBON和SLIT2的敲低可拮抗这一作用，进一步证实了SLIT2/ROBO1在胃癌中的促转移作用。

CAF SLIT2以依赖robo1的方式促进GC转移和细胞骨架重组

磷酸化是维持和增强蛋白质功能的关键翻译后修饰，本研究对nek9介导的TRIM28和CTTN磷酸化的研究结果支持了这一观点。TRIM28首先被发现是一种新的stat结合伙伴。其转录活性在各种类型的癌症中越来越受到关注。磷酸化是其功能的决定因素，因为它与HIF-1的相互作用可导致丝氨酸-824位点磷酸化，并激活靶基因转录以应对缺氧。值得注意的是，在本研究中，丝氨酸-824也是NEK9的磷酸化位点，尽管丝氨酸-824的磷酸化除了对NEK9外，对GC转移没有任何影响。相比之下，丝氨酸-473的磷酸化显著提高了TRIM28促进转移的作用。似乎不是所有的磷酸化位点都具有功能，并且每个功能位点的磷酸化程度是高度可变的。因此，阻断、突变或替换TRIM28的功能性磷酸化丝氨酸残基是另一种方法，可以用来控制GC转移，也可以避免NEK9非选择性沉默的副作用。CTTN(联系蛋白编码基因)参与肌动蛋白细胞骨架和细胞形状的组织，并在板足的形成和细胞迁移中发挥作用[38,39]。CTTN是SLIT2/ROBO1/NEK9通路的效应体，其表达和磷酸化水平对GC细胞形态有显著影响，这与之前报道的CTTN在细胞骨架组织中的功能一致。

本研究发现，与配对的非癌组织和原发癌病变相比，转移性胃癌病变中NEK9、TRIM28和CTTN的表达水平同时升高。对一组GC患者的数据分析显示NEK9、TRIM28和CTTN与总生存率降低相关，且它们的水平呈相互正相关。这些发现被多个在线数据库的分析进一步证实。临床评估数据提示SLIT2/ROBO1/NEK9通路具有临床意义，为该通路关键分子可能作为GC的生物标志物和治疗靶点提供临床前支持。 

综上所述，本研究发现cafa衍生的SLIT2通过增强ROBO1和NEK9之间的相互作用来促进胃癌转移。NEK9作为一种激酶，通过靶向TRIM28和CTTN的磷酸化，触发IL-6/STAT3和NF-κB通路的激活。NEK9桥接了来自CAFs和炎症信号通路的刺激，形成了细胞骨架重组和癌症转移的独特TME。这些发现可能有助于加强对TME在胃癌转移中的作用的理解。（转化医学网360zhyx.com）

参考资料：

https://www.nature.com/articles/s41419-023-05965-z

注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。