突破！曾木圣团队攻克KRAS突变癌症，推出革命性泛KRAS降解剂！

2024年6月28日，中山大学肿瘤防治中心曾木圣团队在《Cell Discovery》杂志发表了题为"A pan-KRAS degrader for the treatment of KRAS-mutant cancers"的研究论文。本研究的数据表明，TKD选择性地与癌细胞中的KRAS结合，并通过溶酶体依赖性过程，有效地诱导KRAS降解。在功能上，TKD抑制肿瘤生长，无明显副作用，增强PD-1抗体和西妥昔单抗的抗肿瘤作用。这项研究，不仅为开发靶向“不可成药”蛋白质的药物，提供了策略，而且还揭示了TKD是一种治疗KRAS突变癌症的有前途的治疗方法。

研究背景

01

据估计，在约20%的人类肿瘤细胞内，RAS基因发生了突变。其中，KRAS是最常见的突变致癌基因。肺腺癌 （LUAD）、胰腺导管腺癌（PDAC）和结直肠癌 （CRC） 具有高度致死性，并且表现出高频率的KRAS突变。突变率分别为32%、86%和41%。KRAS突变体，诱导下游信号级联反应的组成型激活，这不仅有助于肿瘤发展，而且削弱，甚至消除了靶向上游效应物（如表皮生长因子受体（EGFR））的药物的抑制作用。此外，KRAS突变体抑制干扰素调节因子2（IRF2）的表达，从而诱导癌症对免疫治疗的耐药性。

KRAS长期以来，一直被认为，是一种“不可成药”的蛋白质，因为它的球形结构、对GTP具有强亲和力，以及频繁的突变。这些特点，给使用传统策略开发靶向药物，带来了挑战。然而，最近的研究进展，已经确定了KRAS G12C突变体中的结合口袋（S-IIP），可以被小分子靶向。sotorasib和adagrasib等抑制剂，已被证明通过共价与该口袋相互作用，有效抑制G12C突变非小细胞肺癌（NSCLC）的生长。此外，一种名为MRTX1133的选择性KRAS G12D抑制剂，也可以与S-IIP口袋结合，但它与KRAS的相互作用是非共价的。另一种小分子抑制剂，通过阻断KRAS结合的GTP，和KRAS结合的GDP之间的核苷酸交换起作用，其已显示出对KRAS活性的广泛抑制。然而，其对水解活性受损的KRAS突变体（如KRAS G12R和Q61L/R/K）的有效性有限。值得注意的是，这些抑制剂的结合位点，对特定的KRAS突变体，或一类突变体具有特异性。此外，抑制剂对KRAS活性的极度抑制，往往导致不可预测的继发突变的出现。因此，有必要采取替代策略，来开发能够克服这些局限性的泛KRAS靶向药物。

破坏KRAS基因的表达，是消除KRAS突变致癌作用的有吸引力的策略。从理论上讲，DNA编辑和RNA干扰，都可以降低KRAS的表达。但这些策略的操作条件和脱靶效应，目前限制了它们的临床应用。选择性蛋白质降解，是减少癌细胞中KRAS的另一种有前途的策略。为此目的开发的一种技术，是蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）。PROTAC由两个片段组成：E3泛素连接酶的底物或配体，以及靶蛋白的配体。这些片段通过连接子，共价连接。通过将靶蛋白募集到E3连接酶中，PROTAC以蛋白酶体依赖性方式，促进其降解。之前的研究表明，使用这种方法，可以成功降解KRAS G12C突变体。蛋白质降解剂的另一个有吸引力的设计是 Trim-Away，它利用了E3泛素连接酶TRIM21对正常抗体Fc段的天然亲和力。Trim-Away将抗体-靶蛋白复合物募集到TRIM21中，从而诱导靶蛋白的泛素化和随后的蛋白酶体依赖性降解。Trim-Away的功能机制表明，KRAS降解剂可以基于对KRAS具有强亲和力的抗体构建。此外，AdPROM是另一种基于抗体的蛋白质降解剂，涉及将募集CUL2-RING E3连接酶复合物的von Hippel\u2012Lindau （VHL）蛋白与靶蛋白的高亲和力结合剂融合。使用逆转录病毒载体，可以将AdPROM引入靶细胞。使用基于GFP纳米抗体的AdPROM，可以成功降解敲入的绿色荧光蛋白（GFP）标记的KRAS蛋白。当GFP纳米抗体被HRAS单体取代时，降解剂还诱导了内源性未标记KRAS、HRAS和NRAS的强烈降低，表明基于单体的降解，对KRAS不具有特异性。这些发现，证明了使用基于抗体的方法，来设计针对KRAS的靶向药物的可行性。从理论上讲，基于抗体的KRAS降解剂，可以诱导pan-KRAS突变体的降解，因为抗体和抗原的结合，并不局限于特定位点。

基于蛋白质的靶向药物，如西妥昔单抗和帕博利珠单抗，已被广泛应用于癌症治疗。但几乎所有基于蛋白质的药物，都在细胞外空间起作用。为了成功进入细胞，并抑制细胞内靶标的活性，基于蛋白质的药物，尺寸应该很小，结构应该不复杂，以及拥有有效的细胞穿透肽（CPP）。纳米抗体是源自羊驼的抗体重链的可变结构域，其质量数约为15kD，远小于传统抗体（约150kD）。因此，纳米抗体可以很容易地穿透各种组织，并且可以使用原核或真核蛋白质，表达系统生产。纳米抗体是构建新型靶蛋白降解剂的理想平台。

之前的研究表明，来源于布福林IIb的无毒肽BR2，可以选择性地快速、特异性地识别和进入癌细胞。此外，可被溶酶体识别和结合的CTM肽，已被用于诱导靶蛋白的选择性降解。因此，我们采用了一种不同与以往使用的选择性蛋白质降解剂的方法，构建了一种基于靶向KRAS的纳米抗体的新型KRAS降解剂，并将其命名为肿瘤靶向KRAS降解剂（TKD）。TKD包含3个元素：癌细胞穿透肽BR2、与KRAS结合的纳米抗体，以及溶酶体识别和结合基序 CTM。团队研究了TKD在降解KRAS突变体和抑制肿瘤生长方面的作用。考虑到KRAS突变，被认为是免疫治疗和靶向治疗耐药性的有效驱动因素，团队进一步评估了TKD在使癌症对程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）抗体和西妥昔单抗敏感方面的作用。

https://www.nature.com/articles/s41421-024-00699-4

研究进展

02

TKD抑制具有不同KRAS突变的癌细胞的生长

随后，团队探索了TKD的潜在抗癌活性。集落试验表明，在具有不同KRAS突变的癌细胞中，TKD抑制细胞增殖，但TKDm不抑制细胞增殖。进一步的CCK-8检测表明，TKD对具有不同KRAS突变的肺癌细胞、CRC细胞和PDAC细胞的生长，有显著的抑制作用，但对HRAS突变的癌细胞没有抑制作用。此外，团队构建了两种基于H358细胞系（含有KRAS G12C突变）稳定表达R68S/Y96C突变KRAS的adagrasib耐药细胞系。数据显示，R68S/Y96C突变，显著促进了H358细胞对adagrasib的耐药性，但TKD对这些耐药细胞，仍保持较强的抑制作用。

实验数据显示，TKD有效浸润肿瘤组织，表明TKD在体内癌症治疗中具有广阔的应用前景。TKD成功抑制了肿瘤生长。下游信号通路（pERK指示）的活性被抑制，表明TKD对自发性肿瘤，也有很好的治疗效果。

此外，团队比较了TKD和PROTAC LC-2在降解KRAS，和抑制具有不同KRAS突变的癌细胞生长方面的作用。与TKD相比，LC-2只能降解KRAS G12C突变体。此外，TKD可以抑制H358（KRAS G12C）或HCT116衍生肿瘤的生长，而LC-2只能抑制H358衍生的肿瘤生长。TKD还降低了HCT116和H358肿瘤中KRAS的表达，而LC-2仅降低了H358肿瘤中的KRAS表达。综上所述，TKD诱导KRAS降解，并抑制具有不同KRAS突变的癌细胞的生长。因此，TKD比PROTAC具有更广泛的应用。

TKD抑制多种癌症的生长。

TKD使KRAS突变型CRC对PD-1抗体治疗敏感

之前的研究表明，KRAS突变抑制干扰素调节因子2（IRF2）的表达。IRF2是一种抑制髓源性抑制细胞（MDSC）迁移到肿瘤微环境的转录因子，并促进程序性死亡配体1（PD-L1）的表达，从而在肿瘤中产生免疫抑制微环境。考虑到TKD显著诱导突变KRAS降解，团队探讨了TKD在CRC免疫检查点阻断（ICB）治疗中的作用。Western blotting试验证实，TKD处理的癌细胞中的KRAS 降解，导致HCT116细胞中IRF2的增加和PD-L1的减少。流式细胞术检测还表明，在TKD处理的细胞中，细胞表面的PD-L1表达显著降低。因此，TKD可用于逆转突变KRAS诱导的免疫抑制。团队探索了MC38K细胞中TKD的活性，MC38K细胞是一种稳定表达KRAS G12D的小鼠CRC细胞系。数据显示，TKD处理抑制了KRAS的降解和细胞生长。在TKD治疗的肿瘤中，细胞毒性T细胞（CD45CD3CD8）的数量增加，MDSCs（CD45CD11bGr-1）的数量减少，表明TKD逆转了KRAS突变驱动的肿瘤中的免疫抑制。然后，团队单独或联合用TKD或PD-1抗体治疗小鼠。结果显示，联合治疗组禁止肿瘤生长。PD-1抗体和TKD组合的抑制作用，具有协同作用。在PD-1抗体和TKD联合治疗的肿瘤中，细胞毒性T细胞（CD8）积累，而MDSCs（Gr-1）的数量减少。重要的是，对照组和PD-1抗体治疗组，发生严重CRC肝转移，但TKD治疗组和联合治疗组无癌转移，表明TKD显著抑制了CRC的进展。总之，TKD是一种很有前途的药物，可以恢复肿瘤免疫微环境，并增强ICB治疗效果。

TKD恢复免疫微环境，改善ICB治疗。

TKD与西妥昔单抗联合治疗KRAS突变型结直肠癌，

具有良好的疗效

最近的一项研究表明，将KRAS G12C抑制剂与EGFR抗体西妥昔单抗，联合用于KRAS G12C突变CRC患者，具有抗肿瘤活性。此外，蛋白质组学分析还表明，TKD处理可以抑制EGFR信号通路的活性。因此，团队使用含有不同KRAS突变体的临床CRC组织，构建了患者来源的肿瘤异种移植物（PDX）模型，并在KRAS突变CRC PDX模型中，检查了西妥昔单抗和TKD的组合。数据显示，KRAS G12D和G12V肿瘤的生长，均受到协同抑制，G12D肿瘤的CI值为0.289，G12V肿瘤的CI值为0.137。此外，在G12D和G12V肿瘤中，与西妥昔单抗单药组相比，西妥昔单抗和TKD联合组的Ki-67阳性细胞，数量均减少。综上所述，PDX模型的结果表明，TKD在KRAS突变型CRC的临床治疗中，发挥着重要作用。

TKD和西妥昔单抗联合治疗KRAS突变CRC PDX小鼠模型。

研究结论

03

由于在G12X（G12C/G12D）突变体中发现了结合口袋（S-IIP），KRAS变得“可成药”。科学界已经开发了几种针对该口袋的抑制剂，目前正在进行临床试验，或已被批准用于临床治疗。除了G12C和G12D突变体外，大多数其他KRAS突变体，也被发现有助于癌症进展和耐药性。值得注意的是，癌细胞倾向于发展继发性KRAS突变，以抵消sotorasib和adagrasib等抑制剂的作用。团队通过将KRAS纳米抗体，与肿瘤靶向CPP和溶酶体结合基序融合，构建了一种称为TKD的泛KRAS靶向分子。TKD成功降解了不同的KRAS突变体，包括基于KRAS G12C的继发性突变，并在单独使用，或与其他批准药物联合使用时，抑制了KRAS突变体癌症的进展。结果表明，野生型KRAS也可以被TKD降解，但不必担心，其对正常组织的毒性，因为TKD表现出理想的肿瘤靶向能力。

TKD的小尺寸有助于降低其免疫原性和改善组织渗透。然而，它也会导致TKD的半衰期短。此外，当TKD通过内吞作用进入细胞时，一些TKD分子被溶酶体识别和降解，导致只有一部分TKD被释放到细胞质中以结合KRAS。此外，KRAS-TKD复合物的降解，导致细胞内TKD逐渐减少。因此，需要持续施用TKD，直到达到预期的治疗效果。团队的实验数据表明，定期给药TKD，无论是单独使用，还是与其他药物联合使用，都可以在KRAS突变癌症中，产生良好的治疗效果。各种化学修饰，如酰化和聚乙二醇化，可用于增强蛋白质药物的稳定性。一些生物材料，如水凝胶和脂质制剂，也可以延长蛋白质药物的半衰期。人血清白蛋白半衰期长（约19天），因此，白蛋白结合域，和TKD的融合，可能会延长TKD在血液中的循环时间。此外，一些肽已被证明可以有效地破坏内体膜，并促进内容物的释放。并且，这种肽在递送蛋白质中的应用，已显示出卓越的效果。这种肽与TKD的融合，也可以提高TKD递送的效率。

虽然已经有许多基于蛋白质的癌症治疗靶向药物，但大多数仍然靶向膜表面的癌蛋白。例如，人表皮生长因子受体2（HER2）和PD-1。除了治疗KRAS突变癌症外，本研究还为细胞内癌蛋白的靶向药物开发，提供了新的策略。从理论上讲，当TKD的纳米抗体元件，被靶向其他细胞内蛋白的纳米抗体取代时，该分子将成功降解靶蛋白，类似于TKD。因此，这种药物开发策略，可以充分利用“不可成药”的靶点，特别是那些已被证明在肿瘤进展中起重要作用的靶点，来设计靶向药物。这对于未来的癌症治疗，具有重要意义。