【Nature子刊】窥探细胞内的秘密世界：浙江大学药学院程翼宇团队利用scCube，揭示转录组学中的多重变异性！

近日， 浙江大学药学院程翼宇团队在期刊《Nature Communications》上发表了题为“Simulating multiple variability in spatially resolved transcriptomics with scCube”的研究论文。在本研究中，团队提出了一个空间分辨转录组学模拟器scCube，用于模拟空间分辨转录组学中的多个空间变异性，并生成无偏差模拟SRT数据。

https://www.nature.com/articles/s41467-024-49445-0

研究背景

01

空间分辨转录组学（SRT）技术的出现和快速发展，为在空间水平上了解组织的细胞组成、分子结构和功能细节，提供了前所未有的机会。各种新兴的尖端技术，包括基于成像的、基于空间条形码的下一代测序（NGS）和基于激光捕获显微切割 （LCM） 的方法，已成功应用于不同的生物学领域。例如，发育生物学、癌症和神经科学。

随着SRT数据的出现，用于下游分析的计算工具，也越来越先进。目前，科学界已经开发了300多个软件包，用于各种空间转录组的数据分析。例如，空间可变基因检测、细胞类型反卷积、未测量的基因插补票价、空间域识别和空间细胞的相互作用。虽然这些计算方法通常基于合理的假设，但如果没有金标准，就很难对其性能，进行基准测试和评估。

目前，一种广泛使用的评估计算方法，涉及从scRNA-seq数据构建的模拟SRT数据。然而，在scRNA-seq数据选择和用于在不同基准实验中，生成模拟SRT数据的方法方面，存在差异。在大多数情况下，模拟数据是专门基于所评估的计算方法的基础假设构建的，这可能会在评估过程中引入偏差。此外，大多数模拟步骤的描述，缺乏可重复性，可能会阻碍其他研究人员对这些方法的潜在重用。最近出现了几种生成合成SRT数据的方法。例如，SRTsim使用从参考数据推断的计数模型，模拟基因表达计数，然后将模拟计数，分配给合成数据中的空间位置。scDesign3应用了一个概率模型，该模型可以结合不同的细胞协变量，来模拟不同空间位置的基因表达变化。然而，SRTsim和scDesign3都基于SRT数据进行模拟，导致生成的数据，存在固有的局限性。例如，基因检测有限和细胞分辨率低。此外，scDesign3无法使用用户指定的新空间位置，模拟SRT数据，这极大地限制了其应用。然而，SRTsim可以根据参考数据中测量的\（k\）个最近相邻位置，为每个新位置分配模拟表达计数，但当参考数据和合成数据之间的组织形状或细胞类型空间分布，存在较大差异时，这种策略可能无法保留基因的空间表达模式。例如，Maynard等人的DLPFC数据，集中不同脑供体的切片。因此，仍然需要一种能够模拟独立、可重复、各种SRT数据的通用模拟框架，以更好地促进空间转录组数据分析方法的发展。

为此，我们引入了scCube，这是一种SRT模拟器，用于模拟空间分辨转录组学中的多个空间变异性，并生成无偏模拟SRT数据。基于变分自编码器（VAE）框架，scCube可以模拟scRNA-seq（或SRT）数据中不同细胞（或斑点）群体的基因表达谱。接下来，可以通过基于参考或无参考的策略，生成特定种群的空间分布模式。团队评估了scCube在各种真实SRT数据集上，使用现有单细胞或SRT模拟器的仿真性能，并展示了scCube在3个基准测试应用中的实用性。结果表明，scCube是一个用户友好的框架，可以模拟无偏差SRT数据，使研究人员能够更轻松、更准确地，对不同的计算方法进行基准测试和评估。

研究进展

02

使用scCube无参考策略模拟SRT数据中的多重变异性

团队将SRT数据的变异性，细分为两种类型：基因表达变异性和空间模式变异性。对于前者，scCube可以根据模拟的基因表达谱，选择用户指定的基因数量或类型，以模拟基于成像的SRT数据中靶基因的变异性。对于后者，scCube可以使用默认的空间自相关函数生成数量、类型和维度变化的细胞类型的模拟空间模式，并进一步模拟细胞类型（如细胞亚型）内空间模式的变异性，以及基于斑点的SRT数据中分辨率和斑点排列的变异性。团队通过以下3个示例，进行了详细的演示。

1.模拟细胞类型空间模式的变异性

scCube的一个基本功能，是它能够生成具有不同模式的细胞类型的空间分布。在scCube中，有两个重要参数\（\lambda\） 和 \（\delta\），它们分别控制生成的空间模式的模糊度和连续性。\（\lambda\） 的值，范围从0到1，较大的值，往往会形成更清晰的空间模式。因此，用户可以通过设置和组合不同的\（\lambda\）和 \（\delta\） 值，应用scCube，来生成特定的模式，以模拟不同组织中细胞的空间结构。

scCube的另一个功能，是它能够设置空间模式的数量，并仅模拟一组特定单元类型的空间模式。scCube的这一特性，使用户能够更好地模拟，真实组织中的不同情况。例如，特定细胞类型的空间域，或几种细胞类型的定位和分布。此外，用户可以应用此功能，来指定特定细胞类型，是否具有空间分布模式，从而实现手动指定该细胞类型，标记基因的空间表达模式类型。scCube生成的模拟三维SRT数据是无偏的，因此，足以作为基准数据集中的真实数据。scCube还提供了一个“拆分”功能，可以将三维SRT数据，拆分为用户定义的二维SRT数据，模拟数据的任意坐标轴。使用此功能，用户可以研究一系列相邻二维切片的空间变异性。例如，特定细胞类型的空间分布，及其标记基因的空间表达模式。通过联合利用模拟的三维SRT数据，和一系列推导的二维SRT数据，用户可以更准确地评估三维组织重建的计算方法。

2.模拟细胞类型内空间模式的变异性

scCube还提供了一个单独的功能，来考虑细胞类型内的异质性，并灵活地生成细胞亚型的空间模式。

使用scCube模拟细胞类型内空间模式的变异性，以及基于斑点的SRT数据中，分辨率和斑点排列的变异性。

3.模拟分辨率和光斑排列的可变性

scCube还提供了，用于设置每个点的单元数（\（n\）） ，以及所有点的排列和邻域结构的可选参数。这使得在不同分辨率，甚至不同技术平台下，模拟基于点的SRT数据成为可能。

使用scCube模拟生物学上可解释的空间模式

在无参考空间模式模拟中，scCube进一步考虑，以自定义方式，生成更具可解释性的空间模式。用户可以首先模拟，一系列生物学上可解释的空间基础模式，包括非结构化的混合或成簇细胞群、围绕组织结构的细胞环，以及一些外部结构，如血管。然后，通过组合这些基本模式的不同类型和数量，灵活地生成高度定制的复杂空间模式。

使用scCube灵活地模拟生物可解释的空间模式。

研究结论

03

在本研究中，团队提出了一个空间分辨转录组学模拟器scCube，用于模拟空间分辨转录组学中的多个空间变异性，并生成无偏模拟SRT数据。团队证明了scCube在真实SRT数据中，保留基因空间表达模式的能力；并说明了，scCube在对各种SRT分析计算方法，进行基准测试中的实用性，包括斑点反卷积、基因插补和分辨率增强。

scCube设计，包括SRT模拟的两个步骤：基因表达模拟和空间模式模拟。前一步主要基于VAE模型，该模型已成为单细胞组学数据建模的流行工具。团队还证明了VAE模型，可以准确地模拟原始数据的各种特征。例如，scRNA-seq或SRT数据的稀疏性。同时，团队提供了约300个经过训练的组织模型，这些模型与scCube Python包相结合，使用户能够更方便、更快速地，模拟真实组织中细胞的不同空间结构，而无需额外的训练步骤。scCube的一个潜在局限性，是其模拟的基于斑点的SRT数据提供的基本实况，仅限于细胞群水平。因为它在生成合成数据时，首先为每个斑点，分配一个细胞群。这可能不适合直接用于某些，以更精细分辨率运行的SRT分析方法的基准研究。然而，得益于scCube在细胞群注释选择中的稳健性，用户可以在模拟过程中，灵活选择适当粒度的细胞群注释。此外，由于scCube生成的基因表达谱，保持在斑点水平，用户还可以通过相关的下游分析（如斑点反卷积），细化每个斑点的注释粒度。

在空间模式模拟步骤中，scCube提供了两种策略：基于引用和无引用。基于参考的策略，使用SRT参考，旨在模拟基因跨位置的空间表达模式。来自不同测序平台生成的，不同组织的真实SRT数据的基准测试结果显示，scCube优于其他SRT或单细胞模拟器，具有广泛的可扩展性。此外，团队强调了scCube与SRTsim相比的独特优势，这是当前最先进的SRT模拟器。具体来说，scCube首先通过求解最优传输问题，在模拟数据中的单元（或点），与空间参考中的位置之间，构建映射。基于基因表达，然后将细胞（或斑点）映射到空间起源可能性最大的位置。该策略有效避免了组织切片形状、细胞类型比例和分布等外部因素的干扰，从而可以稳健地模拟基因的空间表达模式，无论是在相同切片，还是跨不同切片。相比之下，SRTsim在模拟中严重依赖空间参考的坐标系（即切片形状），当目标模拟数据的形状与空间参考的形状相同或足够相似时，SRTsim确实可以保留基因的空间表达模式。然而，当模拟与空间参考，存在较大差异的数据时，模拟的准确性会急剧下降。

对于无参考模拟，scCube旨在为细胞群，生成随机或定制的空间模式，并将其与模拟的基因表达谱相结合，从scRNA-seq数据重新构建完整的基准数据集。与SRTsim中实现的，从真实SRT数据开始的模拟相比，该策略可以生成模拟的SRT数据，该数据同时提供单细胞分辨率和整个转录组，这适用于评估一些整合方法（如斑点反卷积、基因插补和空间重建）的性能。在本研究中，团队通过设置指定的参数值，详细展示了scCube的无参考空间模式模拟的灵活性：包括基于随机方式的SRT数据中的多重变异性模拟，以及定制的更具生物学可解释性的空间模式的生成。

此外，scCube的一个理想特性，是它能够以用户指定的方式模拟SRT数据，以满足不同的基准测试目的；同时，提供真实数据中不存在的基本事实。具体来说，scCube允许在生成SRT数据时，改变一个特定变量。例如，基因的数量和类型，或空间模式的数量和面积，其允许用户灵活地研究，某些变量对不同计算方法性能的影响。团队还进一步讨论了，可能影响scCube生成的，模拟数据的方法性能的空间变异性。此外，对于3个应用中展示的SRT分析方法，scCube应该适用于其他计算工具的基准测试。例如，空间域识别和空间细胞-细胞相互作用推理方法。团队应用scCube对上述两种方法，进行了基准测试，并证明了空间信息有助于提高空间域识别，和空间近端LR对推理的准确性。综上所述，scCube能够提供可扩展、可重现、逼真的模拟，帮助用户更轻便、更准确地评估各种方法，更好地促进空间转录组数据分析方法的发展。