【Nature子刊】创新突破！上海交通大学俞章盛团队开发出快速、准确的空间可变基因鉴定方法

2024年7月7日， 上海交通大学俞章盛团队在期刊《Nature Communications》上发表了题为“HEARTSVG: a fast and accurate method for identifying spatially variable genes in large-scale spatial transcriptomics”的研究论文。通过对SVG进行聚类，团队揭示了人类结直肠癌数据中，两个不同的肿瘤空间域。其特征是，具有独特的空间表达模式、时空位置和生物学功能，从而揭示了肿瘤的复杂性。

https://www.nature.com/articles/s41467-024-49846-1

研究背景

01

空间转录组学，能够测量组织中的基因表达和位置信息。空间转录组学技术的发展，推动了组织结构的重建，并为发育生物学、生理学、癌症和其他领域，提供了深刻的见解。然而，空间转录组学（ST）数据的复杂性和高维性，对分析方法提出了新的挑战和要求。空间转录组学研究中的一个关键分析挑战，是鉴定空间可变基因（SVG）。其表达与空间位置相关，也称为SE基因（具有空间表达模式的基因）。识别SVG，有助于表征组织内的空间模式，并预测空间域。科学界已经开发了几种用于检测SVG的方法，其趋势是将数据建模为标记点过程，并测试成对点的空间分布和表达水平之间的显著依赖性。

Trendsceek、SpatialDE和SPARK，由于计算复杂度高，对大规模数据集的适用性有限。Trendsceek采用排列策略，来计算不同配对点的多个统计数据，这需要大量的计算工作，并且只能扩展到小规模数据集。在分析高维和稀疏ST数据时，高斯过程框架阻碍了SpatialDE和SPARK中SVG的检测和模型参数收敛。SPARK-X的计算速度，明显快于上述方法，但其有效性在很大程度上，取决于构建的空间协方差矩阵与真实底层空间模式的匹配程度。以上4种方法，通过搜索表达式和位置之间的预定义关系，来识别SVG。由于SVG真实空间模式的任意性，以及由此产生的表达式和坐标之间关系的不确定性，它们对各种空间模式的泛化性有限。scGCO能够识别具有未知确切位置和形状的SVG，但是，由于图切算法在识别SVG候选区域方面的准确性有限，尤其是在稀疏的ST数据集中，因此会出现假阴性。Squidpy的准确性，取决于随机排列的数量。增加随机排列的数量，可以提高结果的可靠性。然而，它的代价，是增加了时间消耗，使该过程更加耗时。

因此，团队建议使用HEARTSVG来克服这些限制，而无需提前了解有关SVG的信息或规范。团队采取相反的方法，识别非SVG，并使用此信息来推断SVG的存在。尽管基因表达与SVG的空间位置之间的关系尚不确定，但可以肯定的是，非SVG在基因表达与空间位置之间“没有关系”。HEARTSVG通过测试全局空间边缘表达式中的序列自相关，来识别非SVG。通过排除非SVG，其余基因被视为SVG。作为一种基于测试的方法，无需假设底层空间模式，HEARTSVG可以检测具有任意空间表达形状的SVG，适用于各种类型的大规模ST数据。团队进行了广泛的模拟，并将HEARTSVG方法，应用于由不同技术（包括10X Visium、Slide-seqV2、MERFISH和HDST）生成的12个真实ST数据集，以证明其准确性、有效性和计算效率。HEARTSVG在模拟中优于现有方法，具有更高的精度指标、计算效率和更低的误报（FP）。在分析真实的ST数据时，HEARTSVG在从不同空间转录组技术，获得的不同数据集中，识别具有不同空间表达模式的具有生物学意义的SVG。HEARTSVG具有扩展到包含数百万个数据点的数据集的潜力，并为研究SVG，提供了一系列精心设计的分析工具，从而能够解开复杂的生物现象。

研究进展

02

HEARTSVG识别SVG并预测空间域

10X Visium是癌症研究中，应用最广泛的商业空间转录组学技术。团队将HEARTSVG应用于人类结直肠癌（CRC）数据集，其使用10X Visium技术生成，涉及4,174个斑点和15,427个基因。团队对这个数据集，进行了无监督聚类和细胞类型注释，并结合了之前的研究信息染色（H&E）组织图像。这种组织，包含5种主要的细胞类型：肿瘤细胞、平滑肌细胞、正常上皮细胞、固有层和成纤维细胞。肿瘤细胞，位于两个不同的区域。HEARTSVG鉴定的SVGs，表现出显著的生物学相关性。与其他5种方法相比，HEARTSVG在19个肿瘤相关的KEGG通路（包括癌症：概述和信号转导）中，显示出更小的P值和更大的基因交叉大小。HEARTSVG表现出最高的AUC（AUC = 0.843，分别为0.727），强调了其生物学可解释性。

对于已识别的SVG，团队利用自动聚类模块，预测了6个主要空间域，并对每个空间域中的SVG，进行了富集分。一些空间域，与特定的细胞类型相关，与无监督空间聚类结果一致。

团队将HEARTSVG，应用于来自同一队列的，另外两个结直肠癌ST数据集和相应的肝转移ST数据集。HEARTSVG 的 AUC （平均 AUC = 0.792） ，高于其他方法。在6个结直肠癌和肝转移空间转录组学（ST）数据集中，与结直肠肿瘤样本中的非肿瘤区域相比，团队检测到肿瘤细胞中，许多线粒体编码基因的表达更高。然而，在肝转移样本中，没有观察到这种现象。团队认为，结直肠癌原发部位的肿瘤细胞，比转移性肝癌部位具有更高的氧化磷酸化（OXPHOS）活性。总体而言，HEARTSVG成功检测到，具有视觉上不同模式的SVG。自动聚类模块，基于位于细胞类型内外的可区分的SVG模式，有效地预测了空间功能域。

a 原始苏木精和伊红染色（H&E）组织图像（左）和无监督空间聚类结果（右）。HE图像中的红色圆圈区域，代表肿瘤区域。b 气泡图显示了不同方法中，19条肿瘤相关通路（x 轴）的KEGG通路富集分析结果。每个气泡代表一个通路，其大小对应于每种方法检测到的通路和SVG的重叠基因大小。图的x轴和y轴，表示不同的方法及其重要性（\（{-\log }_{10}（{{{\rm{p}}}}-{{{\rm{value}}}}）\））。P值由 gProfiler计算。c ROC曲线，说明了使用肿瘤微环境的共同基因模块（左）和结直肠癌亚型的共识分子标记物（右），作为真实SVG的金标准时，6种不同方法的TPR和FPR。d HEARTSVG基于SVG预测4个空间域，并绘制每个空间域中SVG的平均表达。e 具有代表性的SVG，对应于Fig. 3d中的4个预测空间域。f 富集分析，对应,4个预测的空间域。柱线的长度，表示使用 \（{-\log }_{10}（{{{\rm{p}}}}-{{{\rm{value}}}}）\）的丰富。P值由 g：Profiler 计算。

HEARTSVG识别具有空间模式的标记基因

团队分析了由多路复用错误鲁棒荧光原位，杂交产生的小鼠视前下丘脑的2个数据集。MERFISH能够对单个细胞进行空间分辨的RNA分析，具有高精度和高效性。通过MERFISH生成的数据适度稀疏，在超过一半的细胞中，检测到超过40%的基因。第1个数据集涉及6,112个细胞和155个基因，由8种细胞类型组成。第2个数据集，由10种细胞类型组成，涉及5,665个细胞和161个特征（156个基因和5 个空白对照）。HEARTSVG、SpatialDE、SPARK、SPARK-X、scGCO和Squidpy，在第1个MERFISH数据集中，鉴定了133、154、149、141、65和145个基因。在第2个MERFISH数据集中，鉴定了128、161、145、132、46和144 个基因。所有方法的结果，高度一致。然而，SpatialDE错误地将5个空白对照，归类为具有顶级基因等级的SVG。HEARTSVG、SPARK、SPARK-X和Squidpy，报告了1个空白对照组的误报，等级较低；scGCO没有报告假阳性。scGCO遗漏了一些具有清晰空间表达模式的SVG。

在这2个数据集中，HEARTSVG有效地识别了，与空间上位于特定区域的细胞类型相关的SVG。团队利用自动聚类模块，来获取多个空间域。由此产生的空间域，始终与其相应的细胞类型匹配。例如，在第1个数据中，团队分别预测了，对应于少突胶质细胞和兴奋性神经元的2个空间域。总体而言，自动聚类模块，突出了 HEARTSVG软件的实用性。

HEARTSVG在各种数据集中具有普遍适用性

为了评估HEARTSVG的通用性，团队将其应用于更全面的数据集，包括由高清空间转录组学（HDST）生成的小鼠嗅球数据和使用10X Visium的2种不同癌症的ST数据集。HDST数据集巨大而稀疏，由181,367个斑点和19,950个基因组成，超过98%的斑点检测到的基因，少于50个。只有HEARTSVG、SPARK-X、scGCO和Squidpy，可以完美地对HDST数据进行操作，并分别检测到447、89、0和248个SVG。scGCO无法识别此稀疏HDST数据集中的任何SVG。HEARTSVG鉴定了排名靠前的SVG（Gm42418、mt-Rnr1、mt-Rnr2、Cmss1、Gphn）。这些SVGs，显示出明显的空间表达模式，尽管在如此稀疏的数据中，观察基因的视觉空间表达模式，具有挑战性。

10X Visium是癌症研究中最流行的ST技术。因此，团队分析了10X Visium生成的其他ST数据，包括原发性肝癌 （PLC）ST数据集，以及伴脑转移肾透明细胞癌（RCC-BM）ST数据集，旨在展示HEARTSVG的卓越性能。与以前的应用一致，这些数据集中的肿瘤细胞，表现出复杂性和高度异质性，包括同一组织内，具有不同功能的多种肿瘤细胞类型。HEARTSVG有效地识别了癌症ST数据中与肿瘤相关的SVG，并预测了几个具有不同功能的空间域。例如，PLC ST数据，包含3种不同的肿瘤细胞类型。通过HEARTSVG鉴定肿瘤相关SVG，并预测其相应的空间结构域，揭示了这些细胞类型之间的潜在协同功能。此外，团队发现，许多肿瘤相关基因，在肿瘤的“小巢”中比在“大巢”中，表现出更高的表达。SVG检测，有助于进一步了解肿瘤间和瘤内遗传异质性，以及复杂的肿瘤微环境（TME）和癌症机制，这对于了解肿瘤进展和对治疗的反应，至关重要。

a MERFISH数据1（6,112个细胞，155个基因）的已知细胞注释的可视化。b MERFISH数据2（5665个细胞，156个基因和5个空白对照）的无监督空间聚类结果的可视化。c 由HEARTSVG、SpatialDE、SPARK、SPARK-X、scGCO和Squidpy识别的SVG维恩图。d 室管膜、兴奋性和少突胶质细胞类型的代表性标记基因的可视化，以及HEARTSVG在2个 MERFISH数据集中，获得的相应调整后的P值。P值由HEARTSVG计算，并使用Holm方法进行调整。图5c和图5d的上面板，对应于MERFISH数据1。下面板，对应于MERFISH数据 2。

研究结论

03

团队提出了HEARTSVG，一种基于测试的无分布方法，用于快速、精确地，检测大规模空间转录组数据中的 SVG。与现有的SVG检测方法不同，HEARTSVG使用另一种策略，通过排除非SVG基因，来推断SVG的存在，使其能够在来自不同空间技术的各种ST数据集中，以高精度、有效性和泛化性，识别任何空间表达模式的SVG。得益于测试框架和缺乏底层数据生成模型，HEARTSVG具有卓越的计算效率和可扩展性，非常适合大规模空间转录组学数据。此外，HEARTSVG 软件还提供了用于SVG高级分析的各种功能，包括自动聚类、富集分析和可视化工具。

团队的研究评估了HEARTSVG在模拟和真实ST数据上的性能，证明了其在各种情况下的准确性、稳健性和通用性，包括不同数量的细胞、SVG标记面积的百分比、空间模式和空间转录组测序技术。HEATSVG在大多数仿真场景中，具有最高的\（{F}_{1}\）分数，并且具有良好的可扩展性和计算效率。HEARTSVG、SPARK-X、scGCO和Squidpy，能够在100万个细胞的数据集上，成功运行。然而，HEARTSVG和SPARK-X，表现出比 scGCO和Squidpy更低的时间消耗。scGCO实现了出色的误报率控制，但由于候选区域识别的不准确性，其性能会因在稀疏模拟数据集中，忽略大量SV而受到阻碍。其他研究也揭示了scGCO在SVG鉴定方面的局限性。在SVG百分比增加的模拟数据集中，SPARK-X的误报率增加，而HEARTSVG的误报率，保持在较低水平。此外，HEARTSVG可以检测出具有不同空间格局的SVG，而SPARK-X在识别SVG时，具有模式偏好，难以检测出一些非条纹图案和小比例的SVGs标记区域。

团队在3种不同组织（结直肠、肝脏和大脑）的4种不同空间转录组测序技术（10X Visium、Slide-seqV2、HDST 和 MERFISH）的12个数据集上，实施了 HEARTSVG。HEARTSVG 表现出最高的 AUC（平均 AUC = 0.792），证明了其在具有不同数据特征的数据集中的准确性和有效性。在本研究中，团队对3种不同类型癌症（结直肠癌、原发性肝癌和肾细胞癌脑转移）的ST 数据集进行了分析，这些数据集是使用10X Visium生成的，这是一种广泛用于癌症研究的商业ST技术。肿瘤的ST数据，包含很少的细胞类型，其SVG主要与肿瘤细胞相关。HEARTSVG（8个重要通路）、SPARK-X（8个重要通路）、scGCO（7个重要通路）和Squidpy（7个重要通路）在10X Visium结直肠癌数据中，鉴定出比SpatialDE（2个重要通路）和SPARK（2个重要通路）更多的癌症相关KEGG通路。此外，HEARTSVG软件的SVG自动聚类模块，有助于预测具有不同空间表达模式的不同肿瘤相关空间域。在结直肠癌ST数据中，肿瘤细胞位于样本的两个非相邻区域。团队发现，两个肿瘤相关空间结构域，仅在一个肿瘤细胞区域，具有高表达模式，而不是两个区域。基于SVG的空间域预测，揭示了肿瘤错综复杂的功能多样性和超越细胞分类的协同相互作用，为肿瘤组织的生物学复杂性，提供了新的视角。

总体而言，HEARTSVG是一种检测空间可变基因的强大方法，能够识别任意形状的空间表达模式。此外，在HEARTSVG软件中加入自动聚类模块，增强了对生物过程的理解，展示了HEARTSVG在空间转录组学数据分析中的多功能性和潜力。但是，HEARTSVG存在仅依赖空间坐标的局限性。在未来的研究中，将基因表达与相应的H&E组织图像相结合，结合H&E组织图像的信息，将更全面地了解疾病进展中的细胞机制。