耶鲁大学陈斯迪团队：CAR-T和CAR-NK治疗实体瘤的潜力、局限和挑战

2024年8月12日，美国耶鲁大学医学院陈斯迪团队在期刊《Cellular & Molecular Immunology》上发表了题为“CAR-T and CAR-NK as cellular cancer immunotherapy for solid tumors”的研究论文。在这篇综述中，团队探讨了CAR-T和CAR-NK细胞的潜力，以及这些治疗方式目前对癌症，特别是实体瘤的局限性。

https://www.nature.com/articles/s41423-024-01207-0#Sec27

研究背景

01

免疫疗法旨在刺激免疫系统以根除癌症，其彻底改变了癌症治疗，是继手术、放疗和化疗并列的癌症治疗的第4个基石。 目前的癌症免疫疗法研究涵盖了广泛的方法，包括抗体、疫苗、细胞因子、溶瘤病毒、双特异性分子和细胞疗法。 其中，免疫检查点抑制剂（ICI）和过继细胞疗法（ACT）已成为癌症治疗最成功的免疫治疗策略。ICIs阻断免疫检查点，实现了显著的肿瘤消退，并改变了多种实体恶性肿瘤的治疗标准，包括黑色素瘤、肺癌和头颈癌。然而，由于抗肿瘤T细胞的稀缺和记忆T细胞受损，原发性和获得性耐药，仍然很常见。

与小分子药物或抗体不同，细胞具有感知疾病，并动态反应疾病的潜力。细胞免疫疗法涉及将修饰的免疫细胞转移回患者体内，在临床研究中迅速发展，并在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成功，但其在实体恶性肿瘤中的应用，仍处于早期阶段。

在这篇综述中，团队概述了近年来为解决限制CAR-T和CAR-NK细胞有效性的主要挑战而实施的工程策略，展示了细胞免疫疗法的广泛多功能性。最后，团队强调了CAR-NK细胞相对于CAR-T细胞的潜在优势和局限性，并概述了这些癌症疗法的未来前景。

研究进展

02

CAR-T细胞疗法治疗实体瘤的挑战

近年来，科学界在改进实体瘤的CAR-T细胞疗法方面，投入了大量的关注和精力。截至2024年6月，ClinicalTrials.gov数据显示，针对实体瘤的CAR-T细胞临床试验总数为405项，状态各不相同（29项已完成，30项正在积极招募/未招募，179项积极招募或通过邀请入组，90项状态未知，39项暂停/终止/撤回，38项尚未招募）。尽管其在实体瘤中显示出活性迹象，但迄今为止的临床试验结果令人失望，没有观察到持续高的持久反应率。

CAR-T细胞在实体瘤中表现不佳的确切原因尚不清楚，主要是由于生物学信息不足，无法评估治疗的关键方面。大多数评估实体瘤中CAR-T细胞的临床研究，主要报告了通用的肿瘤反应参数和外周血（PB）中CAR-T细胞的存在/持久性。然而，关于CAR-T细胞浸润、表型以及与TME相互作用的关键细节，在很大程度上缺乏。

作为一个说明性的例子，可以引用CAR-T细胞在高级别胶质瘤患者中的应用。目前，科学界已经进行了11项单次报告或I期临床试验，包括约130例患者。然而，仅获得11例患者的输注后病理数据，始终遵循临床驱动的手术适应症或尸检。这些数据表明了几个重要发现：（1）静脉给药时，CAR-T细胞呈斑片状浸润肿瘤；（2）其持久性似乎有限；（3）治疗给药后TME的免疫抑制信号上调。此外，在这些试验中获得的病理数据和液体活检样本，都强调了胶质母细胞瘤抗原逃逸的众所周知的能力。

事实上，实体癌给CAR-T疗法带来了独特的挑战。首先，与具有多个谱系特异性表位的B细胞恶性肿瘤不同，大多数实体瘤内的细胞是异质性的。此外，即使肿瘤抗原与健康细胞共享，在血液肿瘤中，牺牲整个抗原阳性谱系以根除癌症，也是可行的。这是因为骨髓组织的内在特性，可以被消融、细胞还原、用生长因子刺激，甚至移植，使患者能够生存。相比之下，大多数实体瘤起源于广泛的自身免疫交叉反应，会危及生命的组织。因此，确定可以被CAR-T细胞靶向的肿瘤特异性抗原，已被证明是困难的。尽管已经选择了在肿瘤或TAA中过表达的抗原，但在健康组织中，存在不可忽视的抗原表达水平，这引发了对毒性问题的担忧。其次，实体瘤的纤维化肿瘤基质由细胞外基质（ECM）和癌症相关成纤维细胞（CAF）组成，与肿瘤部位的异常脉管系统一起形成物理屏障，阻碍CAR-T细胞浸润和渗透到肿瘤中。实体瘤的免疫抑制TME，以众多抑制性免疫细胞为特征，如调节性T细胞（Tregs）和髓源性抑制细胞（MDSC），以及免疫抑制配体和试剂，如程序性细胞死亡1配体1（PD-L1）、TGF-β和腺苷，进一步阻碍了CAR-T细胞的细胞毒性、活性、增殖和对抗实体瘤的持久性。

提高CAR-T细胞的临床安全性

尽管CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了临床上的成功，并有望成为实体瘤的转折点，但该疗法仍然受到CRS和神经毒性等危及生命的副作用的困扰。CRS是一种全身性疾病，在最严重的病例中表现为全身症状、发热、低血压和器官功能障碍。它是由细胞因子的大量释放引起的，IL-1和IL-6、CAR-T细胞和TME细胞，在CAR-T细胞识别癌细胞时，起关键致病作用。CAR-T神经毒性，也称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（immunoeffector cell-associated neurotoxicity syndrome， ICANS），是一种中毒性脑病，在发病机制上与CRS密切相关。在注册试验中，CRS的患病率极高，导致得出的结论是，在一定程度上，所有接受CAR-T治疗的患者都会发生CRS，而大约一半的患者会出现神经毒性。值得一提的是，用于研究体内CAR技术的常见实验设计，未能充分概括这种风险。CRS首次在临床环境中被描述，而临床前研究并未预料到这一点，这一事实就证明了这一点。在一篇具有里程碑意义的论文中，强调了IL-1和IL-6在CRS和ICANS中的关键作用，Norelli等人评估了脑膜炎症的组织病理学体征，并将致死性神经毒性定义为在没有CRS标准的情况下，先于运动障碍或癫痫发作而死亡。

目前ICANS的治疗包括高剂量类固醇疗程，同时降低了CAR-T细胞的临床有效性。因此，深入了解这种表现的病理生理学，对于提出能够保留CAR-T抗癌活性的靶向治疗，将非常有益。

另一个活跃的研究领域旨在降低脱靶毒性活动的风险，这可能被证明对实体瘤的应用至关重要。其中，synNotch调节的CAR，使T细胞仅在存在特异性启动抗原的情况下表达CAR，从而提高了反应的特异性，同时保留了CAR-T细胞，免受持续表达的CAR提供的强直信号传导的影响。抑制性CARs也可以阻止CAR-T细胞脱靶激活。分裂激活信号转导（AND）和抑制性CAR （NOT）的结合，允许将布尔逻辑门集成到癌症免疫疗法中，从而提高靶向癌细胞的精度。

值得一提的是一种合成生物学解决方案，可以减轻靶向（CRS 和 ICANS）和脱靶毒性，由可切换的CAR-T细胞组成，这些细胞可以通过调节分子的给药进行调节，以从非活性（OFF）转变为活性（ON）状态，反之亦然。这些结构大致可分为两个系列，OFF开关和ON开关。后者的额外优势，是保护CAR-T细胞免受强直激活诱导的衰竭。

CAR-T面临的挑战和克服实体瘤的工程策略。治疗实体瘤给CAR-T细胞带来了三大挑战：肿瘤异质性、肿瘤浸润和抑制性肿瘤微环境（TME）。肿瘤抗原有两种类型，一种是仅在肿瘤细胞中表达的肿瘤特异性抗原（TSA），另一种是也可以在正常细胞中表达的肿瘤相关抗原（TAA）。同时，肿瘤细胞也可能在不同水平上表达肿瘤抗原。为了克服异质性，人们已经努力设计具有两种不同 scFvs （TanCAR） 的 CAR 或表达两种识别不同抗原的不同 CAR （双特异性 CAR）。双特异性 T 细胞接合器，可以将肿瘤抗原和 CD3 复合物连接起来，从而启动 T 细胞肿瘤杀伤。实体瘤还具有物理屏障和细胞外基质，可限制CAR-T细胞浸润。为了克服这一挑战，研究人员尝试了CAR-T细胞的局部递送，工程化趋化因子受体表达CAR，FAP靶向CAR，或EMC修饰CAR-T或溶瘤病毒。免疫抑制性TME是另一个巨大的挑战，它包括抑制性免疫细胞浸润，免疫抑制因子（如TGF-β）以及化学环境改变。研究人员试图通过基因缺失、给予抗 PD-1/PD-L1 抗体或 T 细胞自分泌抗体，来阻断 PD-1 等免疫检查点。此外，科学界还努力设计细胞因子臂或表达细胞因子受体的CAR，用PD-1或TGF-β中的激活结构域替换抑制结构域，作为转换受体，并删除T细胞内部负调节因子或过表达T细胞功能增强剂。

CAR-NK细胞疗法治疗实体瘤的挑战

虽然目前CAR-NK细胞的临床经验，主要来自血液系统恶性肿瘤，但对NK细胞生物学特性的了解和临床前发现，可以帮助预测其在实体瘤应用中的潜在陷阱。与CAR-T细胞类似，CAR-NK细胞在实体瘤中的应用，面临着与向肿瘤运输相关的挑战。尽管NK细胞在协调抗肿瘤反应方面，发挥着至关重要的作用，但它们在几种实体瘤中的存在往往有限，这表明它们在TME内难以到达、浸润和持续存在。此外，实体瘤中浸润的NK细胞通常表现出功能失调的表型，部分原因是TME中存在缺氧和可溶性抑制因子等有害因素。最后，基于NK细胞的免疫疗法，必须应对短半衰期和短期抗癌活性。尽管CAR-NK细胞的持久性与其在血液系统恶性肿瘤中的应用一样，是一个挑战，但在实体瘤中，它变得更加重要。

CAR-NK细胞的局限性

尽管CAR-NK具有有前途的特性，但仍存在一些重大局限性，阻碍了其在治疗实体瘤方面的成功应用。其中许多限制与CAR-T治疗相关的限制相似，例如肿瘤浸润不良，以及与TME的有害相互作用。 此外，NK细胞在其生物学和功能方面，具有独特的特定局限性。

对病毒转导的抵抗力

CAR-NK细胞应用的主要局限性之一，是与T细胞相比，NK细胞对病毒转导的抵抗力。在最近的一项临床试验中，使用逆转录病毒载体产生CAR-NK细胞，观察到中位转导效率为72.4%。然而，这些数据的广泛变异性（从22.7%到91.1%）代表了一个重大限制，可能会影响对照II期或III期临床试验的统计功效。这一结果是通过在转导前一天用IL-2刺激NK细胞和饲养层细胞获得的，利用了逆转录病毒对感染活跃复制细胞的偏好。在FDA目前批准的6种CAR-T细胞产品中，4种采用慢病毒载体（Carvykti、Kymriah™、Breyanzi®和Abecma®），2种采用γ逆转录病毒（Yescarta™和Tecartus™）。尽管目前没有临床数据表明一种策略优于另一种策略或更安全，但至少对于当前一代病毒载体而言，必须注意的是，γ逆转录病毒优先插入增强子和启动子附近，这意味着与慢病毒载体相比，插入诱变的风险更高。当接受γ逆转录病毒编辑的HSCs治疗的X连锁严重联合免疫缺陷患儿发展为白血病时，这种现象在临床上显著出现。出于这个原因，科学界已经探索了不同的策略，来优化基于慢病毒的NK细胞转导方案。这些策略必须解决慢病毒在NK细胞中触发的抗病毒反应，从而诱导其凋亡。其中，值得一提的是暴露于IL-2、IL-12和IL-21等细胞因子组合，或使用TBK1抑制剂BX759进行预处理，这些药物能够干扰模式识别受体下游的信号。这些研究的结果表明，慢病毒在人原代NK细胞中的转导效率，有可能提高到25-40%，因此，需要进一步的研究和创新的解决方案，来优化NK细胞中的这一过程。

寿命短，持久性差

NK细胞的半衰期短，一旦从具有超生理细胞因子暴露的离体条件转移到体内条件，其持久性较差。这方面可能意味着需要多次输注。对于CAR-T细胞，第二次输注与主要毒性风险无关，但这种策略在CAR-NK细胞中才开始探索。目前的证据似乎表明，多次服用CAR-NK与严重不良事件无关。然而，这些数据来自在实体瘤和血液系统恶性肿瘤进行的3项I期临床试验的中期报告，共招募了19名患者。此外，必须提到的是，在第一项研究中，细胞产物仅瞬时表达CAR，因为它是通过用NKG2D CAR mRNA电穿孔NK细胞获得的，并局部注射到转移部位。因此，需要对该策略的安全性评价，进行进一步的研究。此外，这种方法可能会影响CAR疗法的成本效益，因此，人们正在积极探索重编程CAR-NK细胞，以具有记忆或记忆样特性，旨在长期控制肿瘤。这种研究途径有望解决CAR-NK细胞疗法中，与NK细胞持久性相关的局限性。

CAR-T和CAR-NK细胞的优点和局限性。CAR-T细胞和CAR-NK细胞都表现出明显的优势和局限性。CAR-T细胞具有长期的肿瘤控制能力，但与细胞因子释放综合征、神经毒性、GvHD效应和供体异质性等风险有关。另一方面，CAR-NK细胞具有几个优点，包括降低GvHD的风险，“现成的”生产可行性，降低细胞因子释放综合征和神经毒性的发生率，以及抗原非依赖性杀伤能力。然而，它们确实有缺点，例如使用寿命较短和可能限制肿瘤浸润能力

研究结论

03

FDA最近对已获批的CAR-T细胞产品发出警告，因为在少数接受CAR-T治疗的患者中，观察到T细胞恶性肿瘤。尽管此类事件发生率总体较低（迄今为止报告的27,000多例接受治疗的患者中有22例），但获批的6种CAR-T细胞治疗产品中，有5种的反复报告，导致FDA对这些疗法增加了一类警告。其中3例病例中，癌细胞已被证明含有CAR，表明输注疗法的恶性转化是关键原因。然而，这种恶性转化似乎是一种罕见的事件。目前，导致CAR-T细胞癌变的机制事件正在研究中，尚未就病毒载体直接参与这一过程，得出确切的结论。然而，FDA的警告提供了一个机会，可以审查CAR生产的所有关键步骤，包括其安全性，并评估潜在的解决方案。

解决这些安全性问题的拟议策略，包括掺入自杀基因，如半胱天冬酶9或单纯疱疹病毒酪氨酸激酶，以在毒性或恶性转化的情况下，诱导细胞凋亡。此外，临床试验正在研究替代递送系统，包括CRISPR/Cas9和基于转座子/转座酶的方法。这两种策略都有优点和缺点。很明显，这些技术正处于指数级发展阶段，在安全性、产品质量（例如，转基因递送效率）、物流可行性和成本方面，可能会超过基于逆转录病毒/慢病毒的方法。例如，在团队的实验室中，团队开发了一种基于转座子/转座酶的系统，名为MAJESTIC（mRNA腺相关病毒-睡美人可治疗性免疫细胞的联合工程）。通过使睡美人转座酶成分瞬时，该系统避免了反复转座子动员，进一步降低了插入诱变的风险。

创新生物技术工具，对改进CAR免疫疗法的贡献，才刚刚开始显现其潜力。例如，本文总结的许多克服CAR-T和NK细胞局限性的解决方案，都是通过应用高通量CRISPR技术实现的。此外，从正在进行的临床试验中获得的数据，将使人们能够更深入地理解CAR疗法的局限性，从而能够为功能性基因筛查，设计更精确的读数。生物技术发展与临床试验数据之间的这种动态和良流，代表了CAR-T和CAR-NK疗法向下一代癌症治疗发展的基石，最终导致患者预后得到改善。

参考资料：

1.Riley RS, June CH, Langer R, Mitchell MJ. Delivery technologies for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 2019;18:175–96.

2.Zhang Y, Zhang Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell Mol Immunol. 2020;17:807–21.