【Nature子刊】协和医院李秉璐团队：AMDHD1有望成为治疗胆管癌的新型生物标志物

2024年8月14日，中国医学科学院、北京协和医学院附属北京协和医院李秉璐团队在期刊《Cell Death & Differentiation》上发表了题为“AMDHD1 acts as a tumor suppressor and contributes to activation of TGF-β signaling pathway in cholangiocarcinoma”的研究论文。研究结果强调了AMDHD1在肿瘤发生过程中在TGF-β信号通路中的关键参与，将AMDHD1定位为CCA的潜在新型治疗生物标志物。

https://www.nature.com/articles/s41418-024-01361-y

研究介绍

 01 

胆管癌（CCA）起源于胆管的上皮细胞，是第二常见的原发性肝胆恶性肿瘤。根据解剖学上的区别，CCA分为肝内CCA（iCCA）、肺门周围CCA（pCCA）和远端CCA（dCCA）亚型。东南亚地区CCA的发病率明显较高，尤其是中国和泰国，年均增长4.4%，主要原因是iCCA病例增加，而pCCA和dCCA的发病率正在下降或保持稳定。CCA是最致命的消化道肿瘤之一，其5年总生存率（OS）仅为7%-20%。根治性手术为早期诊断的患者，提供了唯一可能的治疗方法；然而，对于不可切除或转移性病例的选择，仍然严重有限。根据ABC-02试验，吉西他滨和顺铂联合治疗，一直是晚期CCA的标准一线全身治疗。近年来，包pemigatinib、durvalumab、infgratinib和ivosidenib在内的几种创新疗法，已被批准用于改善患者预后。尽管取得了这些进展，但CCA患者的长期生存率仍然令人失望，这主要是由于该疾病的侵袭性和早期肿瘤复发的倾向。因此，确定用于早期诊断的新型生物标志物，并探索CCA致癌和进展的分子机制，具有重要意义。

含酰胺水解酶结构域1（AMDHD1），也称为HMFT1272，定位于染色体12q23.1，并编码一种在组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和维生素D代谢途径中，起关键作用的酶。AMDHD1已被确定为肝脏特异性基因，受HNF4α和miR-122的负调控，在肝脏发育中发挥重要作用。最近的研究已经开始阐明，其参与肿瘤发生和进展。通过转录组学和蛋白质组学分析，在肝细胞癌和肾上腺癌中观察到AMDHD1的下调。 此外，AMDHD1内的单核苷酸多态性，特别是rs11826 C>T，与其表达的上调有关，从而提供了对乳腺癌风险的保护作用。在目前的研究中，团队证明了AMDHD1与SMAD4和SMAD2/3相互作用，激活了转化生长因子β（TGF-β）信号通路，随后抑制了CCA细胞的恶性特征，揭示了AMDHD1在癌症生物学中的作用，并为治疗干预，提供了潜在的新途径。

TGF-β信号通路有助于调节多种细胞生物学过程，包括细胞增殖、迁移、凋亡、分化，以及肿瘤起始和进展。SMAD蛋白在TGF-β通路中，充当关键信号转导分子，将细胞外信号直接传递到细胞核。当TGF-β与其两个跨膜受体TGF-βRI和TGF-βRII结合时，TGF-β信号级联的激活开始，这触发了SMAD2/3的磷酸化，并促使它们与SMAD4结合。然后，这种新形成的异二聚体SMAD复合物迁移到细胞核并调节靶基因转录，从而影响一系列生物过程，并导致细胞状态特异性转录调控。TGF-β/SMAD信号转导，在肿瘤发生中的作用是矛盾的，因为它既可以抑制肿瘤，也可以致癌，这取决于癌症的类型和阶段。在肿瘤发展的早期阶段，TGF-β信号通过阻断细胞周期和诱导细胞凋亡起到抑制作用。然而，随着肿瘤的进展，癌细胞越来越多地忽视抑制信号，开始分泌TGF-β蛋白，从而促进肿瘤血管生成、转移和免疫逃避。破译驱动TGF-β信号从肿瘤抑制因子转变为致癌因子的条件和机制，仍然是癌症生物学中一项重大而持久的挑战。

在本研究中，团队利用多个生物信息学数据集，并分析了108个临床样本，来评估AMDHD1在CCA中的表达，检查其与临床病理特征和患者生存率的相关性。此外，团队探索了AMDHD1在体内和体外，对CCA细胞增殖和迁移的抑制功能。蛋白质组学分析显示，AMDHD1通过TGF-β依赖性机制，减轻了CCA细胞的恶性肿瘤。SMAD4是AMDHD1诱导的TGF-β信号转导激活的关键介质。AMDHD1与SMAD4的MH2功能域结合，阻止泛素介导的SMAD4蛋白降解，从而增强其稳定性。此外，AMDHD1可促进SMAD2/3的磷酸化，通过其与这些分子的相互作用，进一步放大TGF-β信号传导。

研究进展

 02 

AMDHD1促进凋亡并阻滞CCA的细胞周期

为了更深入地研究AMDHD1的生理功能，团队使用cBioPortal数据库确定了304个与AMDHD1相关的共表达基因，并进行了GO和KEGG分析。AMDHD1可能主要定位于细胞质中，并参与蛋白水解、细胞生长、凋亡、EMT和SMAD蛋白信号转导等过程。AMDHD1及其共表达基因，可能参与调节细胞周期、TGF-β信号通路、AMPK信号通路和氨基酸的生物合成。

AMDHD1的过表达，增加了凋亡HUCCT1和QBC939细胞的百分比，而敲低AMDHD1降低了RBE和HCCC-9810细胞系的凋亡。AMDHD1过表达上调了BAX和裂解CASP3的表达，同时降低了BID和BCL-2的水平。相反，敲低AMDHD1导致BAX和裂解的CASP3表达降低，以及BID和BCL-2水平升高。这些发现共同表明，AMDHD1可以激活CCA细胞中的凋亡途径，强调了其在癌症生物学中的潜在意义。

AMDHD1的过表达，导致HUCCT1和QBC939在细胞周期的G1/S期积累，而HUCCT1细胞系中的AMDHD1敲低，导致G1期细胞百分比增加。过表达AMDHD1的CCA细胞中，细胞周期抑制剂p21上调，CDK4和CCND1水平降低。相比之下，具有AMDHD1敲低的细胞表现出p21水平降低，CDK4和CCND1表达增加。鉴于CDK4和CCND1是从G1期过渡到S期的关键调节因子，AMDHD1可以阻碍G1/S通过p21/CDK4通路的进展，凸显了其在CCA细胞周期中的潜在调控作用。

AMDHD1促进胆管癌（CCA）细胞凋亡并阻滞细胞周期。

AMDHD1与CCA中SMAD4的表达相关

AMDHD1过表达诱导的肿瘤生长抑制，在SMAD4 耗尽后被逆转。SMAD4蛋白在AMDHD1-OV组，肿瘤组织中表达上调。与对照组相比，AMDHD1-OV组Ki67、CD31和CD34的表达水平降低，SMAD4下调后，表达水平降低被抵消。此外，AMDHD1过表达组的TUNEL染色水平增强，SMAD4敲低后TUNEL染色水平降低。根据AMDHD1和SMAD4的表达水平，CCA患者分为3组：AMDHD1和SMAD4均高表达的A组（n=37），混合表达谱的B组（AMDHD1高和SMAD4低表达，反之亦然；n = 30），以及AMDHD1和SMAD4均低表达的C组 （n = 29）。A组的OS率最高，而C组的OS率最差。这些发现表明，AMDHD1和SMAD4表达水平低的CCA患者，发生侵袭性疾病的风险更高。

AMDHD1与胆管癌（CCA）中的SMAD4相关。

研究结论

 03 

识别新的驱动基因并阐明其调控肿瘤起始和进展的分子机制，在开发靶向治疗和改善CCA患者预后方面，具有巨大的潜力。在本研究中，团队初步发现CCA中AMDHD1下调，这与不良的临床病理特征和不良预后有关，提示AMDHD1可能作为CCA的预后标志物。AMDHD1的过表达在体外显著抑制了CCA细胞的增殖和迁移，并在体内抑制了肿瘤的生长和转移。此外，AMDHD1被证明可以通过p21/CDK4通路破坏G1/S期进程，并触发CCA细胞中的凋亡通路。蛋白质组学测序分析，证实了AMDHD1在CCA中的生物学意义，将其作用归因于TGF-β信号通路的调节。

多种功能富集分析表明，AMDHD1与其共表达基因、差异表达蛋白和结合伙伴一起，参与TGF-β信号通路。AMDHD1的过表达，导致CCA细胞中p21和PAI-1的上调和c-Myc的下调，表明AMDHD1直接增强了TGF-β信号传导。此外，AMDHD1对TGF-β信号转导直接靶点和CCA细胞恶性表型的影响，被TGF-β受体抑制剂消除，表明AMDHD1以TGF-β依赖性方式运行。考虑到AMDHD1在TGF-β信号传导中的支持作用，CCA中AMDHD1的缺失和突变，可能会损害TGF-β信号传导的肿瘤抑制功能，从而促进肿瘤发生。

AMDHD1通过MH2结构域，与SMAD4相互作用。这种相互作用阻碍了SMAD4泛素化和降解，从而提高了SMAD4水平，并降低了CCA细胞的活力和迁移。AMDHD1介导的pSMAD2/3，对它们的相互作用至关重要，强调了进一步研究受AMDHD1影响的pSMAD2/3上的特定磷酸化位点，及其在TGF-β信号传导中的作用的重要性。综上所述，团队提出了一种调控模型，其中AMDHD1通过MH2结构域相互作用抑制SMAD4降解，同时促进SMAD2/3磷酸化，从而激活TGF-β信号传导，并影响CCA中的细胞周期、凋亡和侵袭动力学。AMDHD1可以同时与SMAD4和SMAD2/3结合，未来需要进一步研究AMDHD1是否充当支架蛋白，促进SMAD蛋白的整合和核易位。团队基于AMDHD1和SMAD4的表达水平建立了预后分层，揭示了AMDHD1和SMAD4水平均低的CCA患者，表现出最差的OS。这些结果表明，AMDHD1和SMAD4表达的联合分析，可以作为识别高风险和侵袭性CCA形式的宝贵工具。未来的研究，可能涉及在临床前CCA模型中开发通过外泌体或纳米探针介导的递送系统，强制表达AMDHD1的治疗策略。

总之，本研究阐明了一种新的调控机制，其中AMDHD1阻碍泛素介导的SMAD4降解，并协同增强SMAD2/3的磷酸化，从而激活TGF-β信号通路，并导致CCA细胞生长和转移的抑制。研究结果将AMDHD1定位为关键的预后标志物和肿瘤抑制因子，通过AMDHD1和SMAD4在CCA中的联合靶向，提供了一种新的治疗途径。

参考资料：

1.Valle JW, Kelley RK, Nervi B, Oh DY, Zhu AX. Biliary tract cancer. Lancet. 2021;397:428–44.

2.Banales JM, Marin J, Lamarca A, Rodrigues PM, Khan SA, Roberts LR, et al. Cholangiocarcinoma 2020: the next horizon in mechanisms and management. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2020;17:557–88.