【Adv. Sci.】哈尔滨医科大学蔡莉教授团队：克服癌症化疗耐药的潜在治疗靶点

11月18日，哈尔滨医科大学蔡莉教授团队在期刊《Advanced Science》上发表了研究论文，题为“m6A-Modified SNRPA Controls Alternative Splicing of ERCC1 Exon 8 to Induce Cisplatin Resistance in Lung Adenocarcinoma”，本研究中，研究人员发现通过CRISPR/Cas9和shRNA技术敲除或敲低SNRPA均可逆转铂耐药性肺腺癌（LUAD）细胞对铂的耐药性。SNRPA过表达增强了铂敏感性LUAD细胞的耐药性。基因本体（GO）分析显示，SNRPA与DNA损伤修复有关。靶向ERCC1第8外显子的siRNA（ERCC1-E8 (+））逆转了SNRPA增强的铂耐药性和DNA损伤修复。此外，研究人员发现IGF2BP蛋白和由IGF2BP1招募的ELAVL1蛋白与SNRPA mRNA结合。ELAVL1在SNRPA依赖的情况下促进了铂耐药性、DNA修复和ERCC1-E8 (+)表达。在小鼠异种移植模型中，SNRPA敲除CRISPR增强了LUAD细胞对铂的敏感性。总的来说，这项研究阐明了SNRPA在铂类药物耐药中的作用，从而为可能提高化疗敏感性和改善LUAD患者预后的新途径提供了依据。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202404609

背景知识

 01 

肺腺癌（LUAD）是致死率最高的癌症之一，其特征是早期诊断困难、复发率和转移率高、预后不佳。根据分期不同，LUAD的治疗方法也不同，包括手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗。大多数LUAD病例在晚期被诊断出来，无法手术治疗，治疗选择有限；因此，化疗仍然是治疗LUAD的主要策略。铂类化合物，包括顺铂，仍然是LUAD化疗的基础。通过形成DNA-铂复合物和刺激癌细胞的凋亡信号通路，顺铂治疗为患者提供了显著的生存优势；然而，顺铂耐药限制了其治疗效果，并导致LUAD患者的癌症复发。因此，发现可靠的预测顺铂反应或耐药的指标以及更深入地了解顺铂化疗耐药的分子机制是至关重要的。

除了内在原因外，LUAD中顺铂耐药还可以通过各种机制获得。顺铂主要靶向染色体DNA，导致大量DNA损伤，阻碍转录和复制。为了修复顺铂引起的DNA损伤，细胞激活DNA损伤反应（DDR）并启动一系列复杂的机制，包括DNA损伤修复途径。实际上，顺铂引起的DNA损伤在多种癌症中，包括肺癌，都是通过核苷酸切除修复（NER）、跨链交联（ICL）修复、错配修复（MMR）、同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）进行修复的。先前研究发现，TRIM44增强BRCA1介导的同源重组，通过对FLNA的去乙酰化作用促进顺铂化疗耐药。

结构特异性内切酶ERCC1-XPF是一种多功能异二聚体，对于DNA损伤修复至关重要，包括NER、HR和ICL修复。ERCC1表达水平升高与多种恶性肿瘤（包括LUAD）在接受顺铂治疗后较差的治疗结果相关。通过抑制ERCC1和XPF之间的蛋白质-蛋白质相互作用，这种抑制剂增强了LUAD细胞对铂类药物的敏感性。然而，控制ERCC1和XPF之间相互作用的具体因素和分子机制仍有待完全阐明。

SNRPA增强LUAD细胞体外和体内顺铂耐药

 02 

为了研究SNRPA是否与顺铂诱导的获得性耐药有关，研究人员评估了顺铂处理的LUAD细胞中SNRPA的表达水平。研究人员观察到顺铂敏感的A549和H1299细胞在顺铂剂量增加或治疗时间延长后SNRPA表达逐渐增加，这表明了剂量和时间依赖关系。此外，与顺铂敏感的亲本相比，顺铂耐药细胞（A549/DDP和H1299/DDP） SNRPA表达显著增加。

SNRPA的耗竭逆转了顺铂耐药细胞的顺铂化学耐药

因此，在功能研究中，顺铂耐药细胞被用来建立功能丧失模型，而亲代LUAD细胞被用来建立功能获得模型。利用CRISPR/Cas9技术，研究人员通过慢病毒构建成功敲除了A549/DDP中SNRPA缺失的CRISPR克隆的SNRPA mRNA和蛋白水平，并与CRISPR阴性对照克隆（NC）进行了比较。为了提高研究结果的有效性，研究人员设计了靶向SNRPA的特异性shRNA，以及阴性对照，并将其转染到H1299/DDP细胞中。值得注意的是，在没有顺铂治疗的情况下，SNRPA敲低和敲除均未影响化疗耐药LUAD细胞的增殖、凋亡或DNA损伤。同样，未经顺铂治疗的体内实验显示，敲除SNRPA不影响肿瘤生长。

与预期一致，当顺铂浓度逐渐增加时，SNRPA敲除细胞显示出较低的50%抑制浓度（IC50）。与这些发现一致，H1299/DDP细胞对顺铂的耐药性被逆转。流式细胞术和蛋白质免疫印迹实验检测SNRPA缺失对顺铂诱导的细胞凋亡的影响。SNRPA沉默明显增加了顺铂处理的A549/DDP细胞的凋亡比例，这与抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降和促凋亡蛋白BAX的表达上升相吻合。与注射NC细胞的NC组相比，SNRPA基因敲除使裸鼠腋窝区LUAD细胞的顺铂耐药性减弱，表现为荧光素酶活性降低，肿瘤体积减小，肿瘤重量减轻。在来自异种移植物的连续组织切片中，免疫组化染色显示，与NC组相比，KO组的标本中BCL2表达减少，BAX表达增加。

研究人员通过慢病毒感染成功建立了稳定的SNRPA过表达克隆，并通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹实验分析验证了这一结果。CCK-8、菌落形成和EdU测定用于评估顺铂的细胞毒性。CCK-8结果显示，SNRPA过表达诱导A549和H1299细胞对顺铂耐药。在顺铂治疗条件下，通过菌落形成实验和EdU实验评估细胞增殖情况。流式细胞术和蛋白质免疫印迹实验分析表明，SNRPA过表达可抑制顺铂诱导的细胞凋亡。与体外结果一致，稳定的SNRPA过表达克隆（SNRPA）形成的自发异种移植物肿瘤比对照组（Ctrl）表现出更高的荧光素酶活性，肿瘤体积和重量也更大。然而，在不使用顺铂治疗的情况下，SNRPA过表达不影响体外LUAD细胞增殖、凋亡或DNA损伤以及体内肿瘤生长。基于这些发现，研究人员认为SNRPA可诱导LUAD患者产生顺铂耐药。

研究意义

 03

本研究不仅揭示了SNRPA在顺铂耐药中的生物学功能和机制作用，而且揭示了ELAVL1在调节化疗敏感性中的一种新的调节功能。这些发现有助于为靶向选择性剪接和m6A修饰的个性化治疗铺平道路。（转化医学网360zhyx.com）

【参考资料】

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202404609

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