【Nature子刊】精准医疗新进展：东京大学利用CRISPR-gRNA解码小细胞外囊泡的秘密

2024年11月19日，东京大学医科学研究所在期刊《Nature Communications》上发表了题为“Barcoding of small extracellular vesicles with CRISPR-gRNA enables comprehensive, subpopulation-specific analysis of their biogenesis and release regulators”的研究论文。在这项研究中，团队成功识别了以前未知的sEVs释放调节因子，并分别揭示了CD63/CD9 sEVs的外泌体/微囊泡性质，以及CD9 sEVs释放与细胞周期的同步性。CIBER应该是一个有价值的工具，用于对sEVs的生物发生、释放和异质性进行详细研究。

https://www.nature.com/articles/s41467-024-53736-x

关于细胞外囊泡

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细胞释放的膜包裹的细胞外囊泡（EVs）通常根据其大小或来源被分类为几个亚群，包括小EVs（sEVs，直径30-200纳米）、中/大EVs（大于sEVs的EVs）、外泌体（由多泡体（MVB）衍生）和外体（由血浆膜衍生，也称为微囊泡）。其中，含有各种生物分子的sEVs在生理和病理情境下，包括癌症转移中，是细胞间通讯的重要媒介。这些事实突出了sEV生物发生和释放过程作为治疗靶点的潜力。此外，sEVs也因其高度的生物相容性而作为传递囊泡受到关注。

在这项研究中，团队报告了一个高通量池化筛选系统及其在识别sEV释放过程关键因素中的应用。CIBER筛选结合使用多个sEV标记物和生物信息学分析，揭示了控制sEV释放过程的已知和以前未知的因素，揭示了V型ATP酶、线粒体电子传递和细胞周期对CD63和CD9 sEVs释放的不同影响。团队讨论了sEV条形码平台在各种应用中的潜力。

CIBER筛选在癌细胞系中的适用性

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已有研究表明，sEV释放过程的调节因子可能依赖于细胞类型，因此，针对癌细胞特异性的sEV释放过程的抑制，可能是一种有前景的治疗策略。从这个角度出发，团队在表达CD63-dCas9的SH-SY5Y细胞（源自人类神经母细胞瘤）中进行了另一次CIBER筛选，使用的是DTKP库（包含2,333个基因和24,569个gRNAs，药物靶标、激酶和磷酸酶）。这次筛选在该细胞系中成功，支持了CIBER筛选可以被应用到其他细胞系的可移植性。PI4KA再次被检测为排名靠前的候选基因，并被验证为真正的命中，表明这个基因可能在多个细胞系中作为一个强大的sEV释放调节因子。团队还关注了PKM和PGK1作为与HEK293T细胞相比，SH-SY5Y细胞特异性的低丰度候选基因。这些基因的敲低确实在SH-SY5Y细胞中，比在HEK293T细胞中更显著地减少了CD63 sEV的释放，证实了CIBER筛选识别细胞类型特异性sEV释放调节因子的潜力。

基于CD63-dCas9的CIBER筛选结果。

CD63和CD9 sEVs调节因子的比较

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研究结果表明，细胞周期的下调主要对CD9 sEV的释放产生负面影响。正如预期，用依赖于细胞周期的激酶抑制剂dinaciclib阻止细胞周期在G2/M阶段，只抑制了CD9 sEV的释放。此外，团队发现CD9 sEV的释放，而不是CD63 sEV的释放，与M阶段细胞的比例呈负相关，当大多数细胞完成细胞分裂时，CD9 sEV的释放似乎达到最大。这些结果与CD9 sEV的释放与细胞周期同步的观点一致。最后，团队还发现，在两个癌细胞系SH-SY5Y和HT29（人类结肠腺癌衍生的）中用dinaciclib阻止细胞周期主要抑制了CD9 sEV的释放，表明团队的生物学发现具有广泛的相关性。据团队所知，这项研究是第一个证明细胞周期对sEV异质性有影响的研究。

细胞周期的同步化与CD9 sEVs的释放。

总结

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1. CIBER筛选是一种新型高通量筛选方法，能够识别影响sEV生物发生和释放的调节因子。该方法通过将CRISPR gRNAs作为条形码直接加载到sEVs中，实现了对sEVs的高效和均匀条形码编码。

2. CIBER筛选揭示了多条途径对CD63和CD9 sEVs释放的不同影响。该方法排除了sEVs再摄取对培养介质中sEVs数量的影响，提高了结果的准确性。

3. CIBER筛选能够抵消基因KO后细胞中条形码丰度的变化，这对于分析sEV释放调节因子至关重要。

4. CIBER筛选为sEVs的生物发生、释放和异质性的详细研究提供了基础，并讨论了其在各种未来应用中的潜力。

5. CIBER筛选可能有助于发现sEV相关疾病的药物靶标，并应用于更有效地生产具有控制异质性的下一代sEV基础治疗药物。

参考资料：

1.Welsh, J. A. et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J. Extracell. Vesicles 13, e12404 (2024).

2.Hoshino, A. et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature 527, 329–335 (2015).