温故而知新：循环内肿瘤细胞测序与分析最新进展和挑战！

CTC基因组与转录组测序方法

一般来说，CTC测序工作流程可分为四个步骤：CTC富集，CTC分离（特别是单细胞CTC或纯CTC分离），基因组或转录组扩增，测序和分析。

CTC富集

目前已经报道了几种用于从癌症患者血液富集CTC成功的方法。一般来说，这几种方法都使用了两种策略。最常见的策略是利用细胞表面CTC标记物进行富集（EPCAM +，CK +，CD44 +）或删除其中的免疫细胞（CD45 - ）。其代表性平台包括CellSearch，MagSweeper和GILUPI细胞收集器等。另一种富集策略是利用CTCs的大小，密度，声学，流体力等物理特性将CTC从白细胞群体中分离出来，代表性的平台包括ClearCell，ISET。

目前采用的CTC富集系统方法通常将细胞表面标记和物理特性相结合，虽然提高了提高了CTC鉴定的效率和准确性；减少了对DNA,RNA的损伤，但它们都需要至少7.5ml以上的外周血。而GILUPI细胞收集器则通过从外周血液中收集体内的CTC来克服小血液样本所造成的富集困难问题。

CTC分离

CTC从血液中富集后，需将零至数百个CTC从背景细胞中提取出来，科学家通常使用激光捕获显微切割（LCM）和流式细胞仪分析（FACS）。LCM和FACS各有各的优缺点。与LCM相比，FACS以高通量自动地将具有正确标记的特定单个细胞分离成管或孔，而LCM方法允许观察细胞形态学和生理学，以防止可能的污染或细胞损伤。从这个系统分离的细胞是保持生物学特性的，并保留完整的遗传信息，可用于测序和基因表达分类。

基因组或转录组扩增

在从全血获得靶细胞后，应扩增遗传物质以产生足够的模板以创建NGS文库。对于全基因组扩增（WGA），科学家们使用线性或基于PCR的扩增方法；对于全转录组扩增（WTA），开发诸如CEL-seq，STRT-seq和SMART-seq的方法以扩增全转录组或其3'区域。大多数这些扩增方法已经实现试剂盒商业化。

测序和分析

获得足够的遗传物质后，NGS库准备就绪并在标准化协议下进行测序。在从CTC获得测序数据之后，最重要的程序是在样品制备期间评估偏差并设计适当的统计模型以处理这些偏差。

检测肿瘤进展期间临床相关的基因变异

癌症转移和复发是临床治疗的主要挑战，也是癌症患者死亡的主要原因。与原发肿瘤相比，转移性和复发性肿瘤的癌细胞有新的体细胞变异，这增强了治疗过程中的癌细胞逃逸性。在临床实践中，通常难以获得来自转移性或复发性肿瘤的再活检，这导致治疗期间的模糊诊断结果。而液体活检则通过对来自CTC的循环肿瘤DNA（ctDNA）进行测序，使得研究人员在没有活检测序的情况下观察了肿瘤谱中的体细胞变化，这成为基因测序中的一大突破。

推测肿瘤的异质性和进化动态

通常癌症被认为是达尔文进化的结果，因为癌症在单个细胞中不断获得新的体细胞突变，然后经过选择增强特定恶性细胞的适应性和生长优势。理解肿瘤内异质性（ITH）和进化对疾病复发的早期发现和癌症的有效治疗至关重要。目前有三个主要的假设模型解释ITH，包括克隆进化，癌症干细胞和增变表型模型。与仅测序原发性和转移性肿瘤细胞相比，测序CTC提供了额外的数据以进一步探索ITH的复杂性。另外，由于外周血中CTC的存活是肿瘤转移的必要步骤，所以对CTC基因组进行测序可以描绘出更详细的肿瘤演进过程，有助于了解肿瘤转移机制。

许多CTC测序研究已经强调了CTC的遗传异质性，这进一步增加了CTC癌症生物学研究的复杂性。在CTC突变状态中存在高的患者间和患者内异质性。通过检测到的CTC体细胞核苷酸突变体（SNV）构建肿瘤进化过程，并绘制早期干细胞突变（肿瘤演化早期存在的突变）具有相当大的临床应用价值。然而，由于在大多数癌症类型中捕获的CTC数量有限，难以分析个体患者的SNV进化结构。

而且，在癌症进化期间，拷贝数变异（CNV）也经常改变。对癌症治疗期间这些复杂体细胞突变的生物学影响的进一步研究将显著促进我们对癌症进展中CTC生物学的理解以及在疾病监测领域的未来临床应用。

了解肿瘤进展期间发生改变的分子通路

以前的研究已经强调了涉及癌症转移的特定分子通路，如TGF-β信号传导，Wnt信号传导和EMT。然而，大多数这些研究是基于小鼠模型或特定的生物标志物。尽管存在显著的ITH，分析CTC基因表达为了解在转移过程中改变的分子通路提供了一个独特的窗口。单细胞RNA测序的出现（scRNAseq）技术也使得能够使用有限数量的分离的CTC获得全面的基因表达和剪接信息。因此，CTC转录组测序为在癌症进展期间数字化分子通路提供了独特的机遇。

CTC测序的挑战与未来展望

对CTC基因组或转录组进行测序面临着巨大技术挑战，获得足够的细胞进行文库制备和测序是CTC测序的第一个关键步骤。然而，根据不同的分离方法和癌症类型的不同研究可以得出不同的结论。通常，获得足够的CTC进行测序仍然是大多数癌症类型的重要问题，这限制了CTC测序研究的数量。此外，白细胞污染，缺乏特异性生物标记物，低通量和耗时耗力的捕获操作方案也阻碍了CTC测序研究的进展。获得高质量测序文库是CTC测序中的另一关键步骤。

更重要的是，对CTC测序数据的生物信息学分析需要额外的质量评估和评估，特别是样本和测序文库制备过程中引入偏差的评估。基因组扩增期间的脱落（ADO）可能阻止检测CTC体细胞突变等位基因， WGA方法的局限性可能导致基因组覆盖率低，假阳性率高，突变检测的灵敏度低，WGA中的不均一读取分布和嵌合体也可能导致CNV和SV中的伪影 。

随着先进的微流体方法的发展，一些新型的测序技术显示出解决CTC测序技术障碍的希望。例如，科学家现在可以进行原位DNA或RNA测序。这种方法降低了样品处理过程的复杂性以及在CTC富集和分离过程中可能发生的细胞损伤或损失。此外，新兴的单分子测序技术有望在不扩增的情况下分析DNA或RNA分子。

参考文献

1、Zhongyi Zhu & Si Qiu & Kang Shao & Yong Hou. Progress and challenges of sequencing and analyzing circulating tumor cells. Cell Biol Toxicol. https://doi.org/10.1007/s10565-017-9418-5.

（转化医学网360zhyx.com）