【Nature子刊】浙江中医药大学发文：肺癌治疗有效新策略

7月31日，浙江中医药大学研究团队在期刊《Cell Death&Disease》上发表了题为“Downregulation of 4-HNE and FOXO4 collaboratively promotes NSCLC cell migration and tumor growth”的研究论文，本研究发现揭示了EVs的丰度和转染效率之间的直接相关性。两种不同肺癌细胞系共培养可增强EVs的形成、细胞增殖、迁移和致瘤性。mRNA芯片和代谢分析显示共培养细胞来源的肿瘤组织中FOXO信号通路和不饱和脂肪酸代谢显著改变。鸟枪法脂质组学研究和生物信息学分析引导研究人员关注4-羟基壬烯醛(4-HNE)和FOXO4。上调4-HNE或FOXO4水平可减少EVs的形成，阻碍细胞的生长和迁移。而沉默FOXO4表达导致细胞克隆率增加和迁移能力增强。调控4-HNE和FOXO4的产生可能为NSCLC的治疗提供一种有效的方法。

https://www.nature.com/articles/s41419-024-06948-4#Sec9

研究背景

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肺癌是世界范围内最常见的癌症之一，而非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要组织学亚型(85%的肺癌病例)。越来越多的证据表明，肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)与癌症的发生发展密切相关。肿瘤释放的细胞外囊泡(EVs)对细胞持续增殖和抵抗细胞死亡、刺激血管生成、促进侵袭和转移、逃避免疫反应以及修饰TME的影响强调了它们在癌症机制中的重要作用。转移是NSCLC死亡的主要原因，NSCLC转移的具体机制有待进一步研究。

EVs是由多种细胞分泌的细胞源性膜囊泡的异质性群体。根据EVs的生物来源，可以将其分为外泌体和外泌体。外泌体是由多囊泡体和双囊体胞吐释放的小的内体来源的EVs。胞体是通过质膜的出芽和泡形成的。这一过程伴随着质膜边缘的分子重排，导致其脂质和蛋白质组成的改变。非小细胞肺癌细胞释放的EVs可以驱动非肿瘤性肺上皮细胞的侵袭和通透性。

EVs的生物发生和释放已被证明在各种应激条件下增加，包括缺氧，衰老或癌基因激活。氧化应激条件影响细胞外囊泡的释放和分子货物，进而调节靶细胞的氧化还原状态。为了应对异常的能量和氧化还原环境，肿瘤细胞上调抗氧化蛋白的表达，旨在解毒水平升高的活性氧(ROS)。这一过程使氧化还原平衡的建立成为可能，同时维持促肿瘤信号传导并增强对凋亡的抵抗力。这些ROS的过量产生，会干扰细胞的信号传导，进而改变EVs的体积和组成。伴随的是细胞膜上多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)通过自由基链式反应氧化，形成脂质氢过氧化物为初级产物。有研究报道脂肪细胞通过快速而稳定地释放EVs来应对氧化应激。肿瘤细胞上调其脂质代谢机制以满足增加的能量需求。肿瘤细胞通过形成EVs调节细胞间脂质交换，这可能是肿瘤细胞抵抗缺氧诱导的氧化应激导致的脂质过氧化死亡的有效途径。

4-HNE和FOXO4共同减少EVs的形成，抑制共培养肺癌细胞的生长和迁移

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研究人员探讨了FOXO4和4-HNE的相互调控，以及它们对肿瘤细胞增殖，迁移和细胞外囊泡形成的影响。集落形成实验结果显示，与单独培养的A549和H1299细胞相比，A549和H1299共培养的细胞集落数量显著增加。在共培养的AH细胞中，FOXO4和4-HNE的表达显著降低。为了评估4-HNE对EVs形成的影响，研究人员将AH细胞暴露于不同浓度的4-HNE，随后进行扫描电镜观察。结果表明，随着4-HNE浓度的增加，AH细胞表面的EVs数量相应减少。同时，集落形成实验和脂质体转染实验结果表明，随着4-HNE浓度的增加，细胞集落形成能力和转染效率均显著下降。细胞划痕实验显示，随着4-HNE浓度的增加，细胞迁移能力明显下降。为了进一步研究4-HNE与FOXO4之间的潜在关系，双荧光素酶报告基因实验显示，FOXO4的转录活性随着4-HNE浓度的增加而增强。RT-qPCR结果显示，FOXO4 mRNA水平随着4-HNE浓度的增加而升高。加入4-HNE时，FOXO4蛋白表达水平也呈剂量依赖性增加。

4-HNE和FOXO4对共培养肺癌细胞EV形成及致癌性的影响

为了进一步研究FOXO4的作用，研究人员在AH细胞中过表达FOXO4。结果表明，FOXO4过表达组中4-HNE蛋白水平升高，集落形成减少。此外，为了评估FOXO4对EVs形成的影响，研究人员将flag-FOXO4表达质粒转染AH细胞，并使用扫描电镜观察EVs的形成。扫描电镜显示过表达FOXO4的细胞中EVs数量减少。鉴于FOXO4在AH细胞中表达显著降低，而在A549细胞中表达最高，研究人员使用shRNA方法敲低A549细胞中的FOXO4。研究人员首先筛选了最有效的构建质粒，随后进行了蛋白质免疫印迹分析、克隆形成实验和划痕实验。结果表明，FOXO4敲低导致4-HNE水平降低，细胞集落数量增加，细胞迁移率增强。

研究小结

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总之，研究人员发现当两种不同的非小细胞肺癌细胞共培养时，它们会通过EVs交换信息，从而促进细胞的恶化。在此过程中，4-HNE和FOXO4的表达水平均下调。FOXO4的活性与4-HNE的水平呈正相关。4-HNE和FOXO4均可抑制EVs的形成。因此，调节4-HNE的产生和FOXO4的活性可能是治疗NSCLC的一种有效策略。（转化医学网360zhyx.com）

参考资料：

https://www.nature.com/articles/s41419-024-06948-4#Sec9

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